鸢尾黄素对甲醛诱导PC12细胞凋亡的保护作用

鸢尾黄素对甲醛诱导PC12细胞凋亡的保护作用

罗焱邹伟陈勇军舒宝莲李文婷张平

南华大学附属南华医院神经内科湖南衡阳421001

【摘要】目的基于鸢尾素的抗凋亡作用，本研究利用甲醛的神经损伤作用，来探

讨鸢尾黄素对甲醛诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化细胞PC12细胞凋亡的影响

。方法利用一定浓度的甲醛处理PC12细胞建立神经细胞损伤模型，酶标仪对细胞

的活力进行检测，采用WesternBlot方法对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平进

行检测。结果与对照组相比，120μM的甲醛诱导PC12细胞24h后，细胞的活力明

显降低（P<0.001），Bax蛋白的表达水平明显增加（P<0.001），Bcl-2蛋白的

表达水平明显减少（P<0.001）。鸢尾黄素（100μM）与甲醛共处理PC12细胞

可明显改善甲醛诱导的细胞活力损伤，显著降低甲醛诱导的Bax蛋白的表高达和增

加甲醛诱导的Bcl-2蛋白的低表达。结论鸢尾黄素能够对抗甲醛对PC12细胞凋亡

的诱导作用，其作用机制可能与降低促凋亡蛋白的表达，提高抗凋亡蛋白的表达

有关。

【关键词】鸢尾黄素；PC12细胞；甲醛；凋亡

鸢尾黄素是从鸢尾属植物中提取的主要有效成分，是一种天然的异黄酮

类化合物。研究表明[1，2]，鸢尾黄素具有雌激素样、抗炎、抗氧化等多种生物活

性作用，并有良好的肝脏保护作用。本研究利用甲醛（formaldehyde，FA）致

PC12细胞损伤作为体外模型，探讨鸢尾黄素对甲醛致神经细胞损伤的保护作用，

为其预防和治疗甲醛的神经毒性提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验细胞PC12细胞购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞库

。

1.1.2主要试剂鸢尾黄素购于湖南科泰生物技术有限公司。甲醛购买于

美国Sigma公司。DMEM培养基购自HyClone公司，胎牛血清购自杭州四季青生物

工程材料有限公司。CCK-8试剂购自日本Dojindo分子科技公司。Bcl-2抗体和Bax

抗体购自Abcam公司。β-actin抗体购自Proteintech公司。山羊抗兔抗体购买于康

维世纪公司。

1.2方法

1.2.1PC12细胞的体外培养将PC12细胞接种于经消毒灭菌后的培养瓶

或者培养板中，用含有10%小牛血清以及100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的

DMEM培养基培养，在37℃、5%CO2的条件下置于细胞培养箱内孵育一定的时

间。所有的实验中，待细胞生长至70%-80%左右，用不同的药物处理PC12细胞

24h后，再进行相关的实验。

1.2.2实验分组取同一代PC12细胞，待细胞生长到亚融合状态时，随机

分为5组：空白对照组（C）、甲醛损伤组（120μM）（FA）、低浓度鸢尾黄素

保护组（50μM）（（FA+TG1），高浓度鸢尾黄素保护组（100μM）（FA+TG2

），单用鸢尾黄素组（100μM）（TG2）。鸢尾黄素预处理30min后，再加入浓度

为120μM的甲醛溶液，继续培养24h，然后进行相应指标检测。

1.2.3CellCountingKit-8（CCK-8）法检测细胞活力将对数生长期的细胞接种于

96孔板中，每孔加入100μl细胞悬液，每组设四个重复孔，将培养板放在37℃、

5%CO2的培养箱中预培养，待每孔中的细胞密度生长至70%-80%时，根据不同

组别给予一定浓度的甲醛或鸢尾黄素处理24h后，然后在每个培养孔中加入4μL

的CellCountingKit-8（CCK-8）溶液继续培养3h，在波长为450nm的条件下，

使用酶标仪检测吸光度即OD值。

1.2.4Westernblot法检测Bcl-2和Bax蛋白的表达将对数生长期的细胞接

种到细胞培养瓶中，并且每组设置3个平行实验。按不同组别分别给予相应的药物

处理24h后，收集细胞蛋白。每瓶细胞加入裂解液100μL，冰上裂解30min后，将

细胞溶液收集到1.5mL的EP管中。再将装有蛋白的EP管放入离心机中，在4℃、

12，000rpm的条件下离心10min，吸取上清。并用BCA蛋白定量试剂盒对每组细

胞蛋白进行定量，用25μl的离心管分装后存于-80℃冰箱内备用。根据蛋白的分子

量，配置浓度为12%的分离胶，并在37℃恒温箱中放置20min待其凝固，用滤纸

小心吸出上边残留的水，配制5%浓缩胶，放入孔道梳子，37℃下放置10-15min

，待其凝固。向已经稀释好并分装为16μl的蛋白样品中依次加入4μl的5×上样缓

冲液以及20μl的石蜡油，在温度设定为100℃的PCR仪中进行煮沸，时间为5min

，最后在4℃，12，000rpm的离心机中离心10min后加入孔道中，先恒压80V电

泳跑至浓缩胶和分离胶边界后，将电压调至120V跑至适当位置，电泳结束后，切

掉多余的胶，做好“三明治”，用半干法转膜30min，转膜完成后，用5％脱脂牛奶

常温封闭2h或4℃过夜，用5％脱脂牛奶稀释一抗，Bax，Bcl-2，β-actin的一抗都

按1：2000的比例稀释。再放在摇床上孵育4℃过夜。再用TBST洗膜3次，每次10

min；然后加二抗（1：5000）孵育2h，用TBST洗膜3次，每次15min；用成像仪

显影。

1.2.5统计分析所有数据用SPSS18.0软件进行统计分析，均用平均数±

标准差（mean±SD）表示，组间差异采用单向方差分析（One-wayANOVA）中

的最小显著差异检验（LSD-test），以P<0.05判定为有统计学差异。

2结果

2.1鸢尾黄素对甲醛诱导PC12细胞活力的影响与正常组相比，120μM

的甲醛能明显降低PC12细胞的活力，差异具有统计学意义（P<0.001）。鸢尾黄

素（50μM，100μM）处理30min后能浓度依赖性地改善120μM甲醛所致的PC12

细胞活力损伤，并且差异具有统计学意义（P<0.001）（如表1），提示鸢尾黄素

可改善甲醛对PC12细胞活力的损伤作用。

2.2鸢尾黄素对甲醛诱导Bax蛋白表达的影响PC12细胞用甲醛处理24h

后，Bax蛋白表达明显高于正常组，差异具有统计学意义（P<0.001），而鸢尾

黄素（50，100μM）能浓度依赖性的抑制甲醛诱导的Bax蛋白的高表达，差异具

有统计学意义（P<0.001）（如图1），提示鸢尾黄素能够降低促凋亡蛋白Bax的

表达，从而抑制甲醛诱导的PC12细胞凋亡。

图1Bax及β-actinWesternBlotting结果

1正常组

2FA损失组

3鸢尾黄素+FA组

4鸢尾黄素组

Fig1TheWesternBlottingresultsofBaxandβ-actin

1Thenormalcontrol（C）group

2TheFAcontrolgroup

3Thetectorigenin+FAgroup

4Thetectorigenin+Cgroup

2.3鸢尾黄素对甲醛抑Bcl-2蛋白表达的影响PC12细胞用甲醛诱导24h后

，Bcl-2蛋白表达明显低于正常组，差异具有统计学意义（P<0.001）。而鸢尾黄

素（50，100μM）浓度依赖性的抑制甲醛诱导的Bcl-2蛋白低表达的，差异具有统

计学意义（P<0.001）（如图2），说明鸢尾黄素能上调抗凋亡Bcl-2蛋白的表达

，从而抑制甲醛诱导的PC12细胞凋亡。

图2Bcl-2及β-actinWesternBlotting结果

1.正常组

2.FA损伤组

3.FA损伤组+鸢尾黄素（50μM）组

4.FA损伤组+鸢尾黄素（100μM）组

5.鸢尾黄素组（100μM）组

Fig2TheWesternBlottingresultsofBcl-2andβ-actin

1Thenormalcontrolgroup

2TheFAcontrolgroup

3FA+tectorigenin（50μM）group

4.FA+tectorigenin（100μM）group

5Thetectorigenin（100μM）alonegroup

3讨论

神经系统疾病是较为常见的一种疾病，具有发病率高，覆盖面广的特点

，其损伤机制非常复杂。神经中毒是神经系统疾病的一个很重要的发病原因。因

此，保护神经细胞免受神经毒物的损伤是改善和治疗神经系统疾病的一个重要手

段。

甲醛属于醛类家族，是最简单的有机分子之一，同时，它也是众所周知

的室内和室外污染物[3，4]。甲醛能够影响许多重要的生物系统，包括中枢神经系

统。因此，甲醛对人类健康的神经毒性已经引起了广泛的研究[4，5]。流行病学资

料表明，长期接触大量甲醛的组织学技工和工人表现为行为学和神经学的症状。

许多实验结果证明甲醛能够产生神经毒性作用。体外实验发现，甲醛能够诱导皮

质的神经元和PC12细胞的神经毒性和凋亡[6-10]。体内实验发现，甲醛能够引起

大鼠脑部的形态学改变[11，12]以及诱导大鼠行为、学习和记忆障碍[13-15]。因此

，预防和治疗甲醛的神经毒性作用变得极为重要。PC12细胞来源于大鼠的肾上腺

嗜铬细胞瘤，分化的PC12细胞在形态，结构和功能上具典型的神经细胞特点，已

被广泛地用于神经细胞凋亡，损伤和功能等方面的研究[16]。因此，本研究利用

PC12细胞作为神经细胞的模型，建立一定浓度的甲醛诱导PC12细胞损伤的体外

培养模型。

鸢尾黄素存在于鸢尾科鸢尾属以及射干属的植物根茎中，具有抗氧化和

清除自由基、雌激素样作用、保护肝脏以及抗炎作用等[14，15]。基于鸢尾黄素的

抗氧化作用，本研究选用鸢尾黄素作为一种保护药，探讨其对甲醛诱导PC12细胞

的损伤的保护作用。这里，我们选取了浓度为50μM和100μM的鸢尾黄素预处理

PC12细胞30min，然后再与（120μM）甲醛共处理PC12细胞24h。最终检测了

PC12细胞的活力，Bax蛋白以及Bcl-2蛋白表达的情况。

细胞活力的检测结果表明，甲醛损伤组PC12细胞的活力明显降低。鸢尾

黄素能够明显对抗甲醛所致PC12细胞活力的损伤。

凋亡蛋白的表达水平与细胞凋亡的情况密切相关。Bax蛋白的表达升高和

Bcl-2蛋白的水平的降低通常反应细胞凋亡的增加。本研究结果表明，甲醛（120μ

M）诱导24h后，PC12细胞的Bax蛋白水平较正常组明显升高，Bcl-2蛋白水平较

正常组明显降低。而鸢尾黄素能够抑制甲醛致PC12细胞Bax蛋白的升高和Bcl-2蛋

白的降低，提示鸢尾黄素对甲醛致PC12细胞损伤具有一定的保护作用。

本研究显示，甲醛（120μM）能够诱导PC12细胞损伤。鸢尾黄素对甲醛所致

PC12细胞损伤具有明显的保护作用，其保护机制可能与抑制PC12细胞促凋亡蛋

白表达以及提高抗凋亡蛋白的表达有关。

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