调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中钠Na+浓度的影响

调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中钠Na+浓度的影响

黄崇政唐成雷秋娥刘勇

永州市中医院湖南省永州市425000

【摘要】目的：探讨调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中Na+浓度的影响。方法：取S180细胞接种于小鼠腹腔造成肝癌腹水模型，随机分为空白对照组（NS）、模型组（M）、调营饮组（T），造模后第五天用调营饮汤剂连续灌胃，观察对小鼠腹膜淋巴孔密度的影响及及尿中Na+浓度。结果：T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01），T组尿Na+浓度明显大于NS组和M组，比较差异有显著性意义（P<0.05）。结论：调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，钠离子排出增多，可能是其消腹水作用机制之一。

【关键词】调营饮；S180；肝癌腹水；小鼠

Abstract：ObjectiveTostudyeffectofTIAOYINYINmixtureonconcentrationoftheperitoneallymphaticstomatainS180asciteslivercancermice，suchasdensityofdistribution.Methods：Thirty-twospecialpathogenfree（SPF）Kunmingmicewererandomizedinto3groups：blankcontralgroup（NS），modelcontralgroup（M），TIAOYINYINmixturemodelgroup（T），Makethemold5nddaystostartforthemedicine，after9ndmeasurethemice.Results：ComparedtoNSgroupandmodelgroup，TIAOYINYINmixturecouldsignificantlyenhancedensityofdistribution（P<0.05orP<0.01）.Conclusion：TheseexperimentstudyshowedTIAOYINYINMixtureregulatingperitoneallymphaticstomata，improvingthedrainagefromperitonealcavityinthemalignantascites.

[KEYWORDS]TIAOYINYINMixture，S180livercancerascites，mice

原发性肝癌（Primaryhepaticcancer，PHC）为常见肿瘤，腹水（Ascites）是肝癌常见的并发症之一；肝癌腹水中医学称之为”鼓胀”，又称“水蛊”、“蛊胀”、“蜘蛛蛊”等，被历代医家列为四大难证之一[1，2]。调营饮是治疗肝癌腹水的常用方，疗效肯定，现通过动物实验研究，探讨调营饮可能的作用机理。

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：健康昆明种小鼠36只，SPF级，雄性，4-6同周龄小鼠，体重20-24g，由湖南中医学院实验动物中心提供。

1.1.2实验试剂和仪器：调营饮汤剂由永州市中医院药剂科提供；台盼蓝液的配制：取苔盼蓝0.049g溶于双蒸水1Oml，过滤分装储藏于室温备用；湖南师范大学JSM-6360LV型电子扫描显微镜。永州市中医院检验科半自动生化析仪。

1.1.3瘤株：小鼠S180肝癌株由上海中科院细胞库所保种瘤株。

1.2方法

1.2.1造模

取S180肝癌细胞株，接种于健康昆明小鼠腹腔，取腹腔传代第8日小鼠，选择腹水饱满小鼠，脱颈椎处死，固定于蜡板上，腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后，在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹，抽取乳白色腹水为瘤源，将获取的活体腹水细胞用生理盐水1：3稀释，小心摇匀，然后用苔盼蓝染色，显微镜下计数存活瘤细胞数，并调整浓度到每毫升含有106个瘤细胞，存活率95%。用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到小鼠腹腔。全程严格无菌操作，40min内完成[3]。

1.2.2动物分组和给药：按照完全随机设计，遵照均衡性原则，先将小鼠按体重分层，然后查随机数字表将小鼠随机分成空白对照组（NS）、模型组（M）组、调营饮组（T），每组12只小鼠，用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到除NS组的其它两组小鼠腹腔，造模后第5日，诊断性穿刺小鼠腹腔，如能抽取到腹水，证明造模成功。从造模后第5天开始NS组、M组以0.2mL/10g生理盐水灌胃，1次/d，连续5天，T组予成药0.03g/10g剂量灌胃[4，5，6]，1次/d，连续5天；平均每只小鼠每天给等量鼠料4g/（只?d）；一周换垫料2次，每日换新鲜水1次。

1.2.2观察指标及测定方法：

1.3.1尿Na+离子浓度测定

造模后第九天各组灌胃后，用自制代谢笼收集每组各小鼠2小时尿液，采用半自动生化析仪测定尿中Na+离子浓度。检测Na+采用６-氢氧化锑钾直接比浊法，原理如下：在分散剂和除干扰剂存在下，Na+与６-氢氧化锑钾在分散剂的作用下形成均一的浊度，在620nm波长下检测吸光度大小。简述操作程序如下：（1）分别向标准管、样品管加入试剂0.3ml（2）向标准管加入标准液20ul（3）向样品管加入样品20ul（4）分别向标准管、样品管加入促进剂200ul（5）形成混浊后各管加1ml乙醇稀释液，混匀后测定（6）半自动生化析仪用蒸馏水调零（7）620nm波长下检测吸光度，根据结果换算成Na+离子浓度。

做完尿液标本后拉颈处死小鼠，取小鼠右膈腹膜切成5mmx5mm，分别用2.5％戊二醛和1％娥酸双固定，2％单宁酸液导电处理，丙酮梯度脱水，醋酸异戊脂置换。HITACHC02临界点干燥仪处理，GTKOIB-5型离子溅射仪镀膜，JSM-6360LV扫描电镜观察，加速电压20kV，放大3500倍。数据测量用扫描电镜自带的smileview软件进行，在扫描电镜拍下的图片上测量淋巴孔密度（个/0.1mm2）[7]。

1.3.统计方法

应用SPSS15.0统计软件进行统计分析，实验数据用“”形式表示，结果之间多样本比较用F检验进行方差分析，组间均数两两比较用t检验，以P<0.05和P<0.01表示差异的显著性。

2.结果

2.1尿中Na+离子浓度

T组尿中平均Na+浓度明显高于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01）。结果见表1。

注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01；

2.1各组腹膜淋巴孔分布密度情况

T组腹膜淋巴孔平均密度均明显大于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01），结果见表2。

注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01。

图1调营饮组（T组）实验小鼠第九天

图2调营饮组（T组）腹膜淋巴ⅹ3500倍

讨论

在我国，临床上大部分原发性肝癌是与乙肝病毒感染有关，90%以上合并肝硬化，腹水为终末期肝癌的典型临床表现，对大多数患者而言，缓解腹水引起的症状是治疗的主要目标[8]。目前临床采取的治疗方法较多，疗效有限，各有优缺点。现在采用中西医结合治疗恶性腹水，不但改善症状显著还能延长生存期，且副作用小，显示出其优势，是今后一个发展方向[8]。腹膜淋巴孔是腹膜毛细淋巴管在腹膜间皮上的开口，有主动的物质吸收功能。腹膜腔-腹膜淋巴孔-腹膜下小管和淋巴引流单位-淋巴陷窝-腹膜淋巴管-脉管系是腹膜腔内物质转归的直捷通路，也是巨噬细胞进入腹膜腔执行免疫功能的重要途径，在腹水的转归方面意义重大。

中医方面肝癌腹水的发生与感受湿热邪毒或长期饮食不节、嗜酒过度、七情内伤等引起机体阴阳失衡有关，形成气滞、血瘀、水停腹中，肝气郁结，气滞血瘀，是形成鼓胀的基本条件，脾脏功能受损，运化失职，遂致水湿停聚；肾脏的气化功能障碍，不能蒸化水液而加重水湿停滞，是形成鼓胀的重要因素，病位涉及肝、脾、肾三脏。在病机上由于本病本虚标实，虚实挟杂，调营饮为临床常用方，治予活血化瘀、行气利水。方中当归、川芎、赤芍等以活血化瘀；莪术、延胡索、大黄以行气活血；瞿麦、槟榔、葶苈子、赤茯苓、桑白皮等以行气利尿；陈皮、大腹皮、白芷理气消胀；细辛、肉桂温阳利水；炙甘草、姜、枣调和诸药。共奏活血化瘀、行气利水之功。

本实验研究显示：调营饮T组尿中平均钠离子浓度明显高于NS组和M组。血浆渗透压是影响组织液回流的一个重要因素，提高血浆渗透压有益于腹水的消除，其中降低Na+摄入、促进尿Na+排出、调整离子渗透压是消除腹水的一个重要手段。结果显示本方能使小鼠S180肝癌腹水模型尿中钠离子排出增加，减轻水钠潴留，可能是其消腹水作用机制之一。调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01）。腹膜淋巴孔密度改变，尿离子浓度的影响，可能与调营饮消腹水作用密切的联系，调营饮通过促进调节性媒介物质的释放，引起腹膜淋巴孔开放，尿离子的排出增加，从而引起小鼠尿量有明显增加，消腹水利尿作用十分明显。调营饮中是什么成分促进调节性物质的释放；其具体的机制是什么，有那些媒介物质参与其中，我们将在以后的实验中继续探讨，为其临床应用提供理论基础。

参考文献：

[1]华海青.原发性肝癌病机特点探讨[J].中国中医基础医学杂志，2004，10（2）：38-39

[2]周永兴.现代肝硬化诊断治疗学[M]．人民军医出版社，2008，52（3）：55-56

[3]盛庆寿.青蒿琥酯对S180肝癌小鼠的抑瘤作用及对肿瘤组织VEGF、FasL的影响[J].广州中医药大学学报，2008，36-39

[4]李仪奎.中药药理实验方法学第2版[M].上海科技出版社，1994，779-780

[5]陈谦，孙慧，李强等.医学实验肝癌动物模型的研究进展.中华实验外科杂志，2006：23（3）：377-378.

[6]徐静，李旭.肝癌动物模型的建立[M].实用肝脏病杂志，2005；8（2）：116-118

[7]李慧，李继承.腹膜淋巴孔研究的新进展[J].中国医学科学院学报，2007，22（6）：585-586

[8]吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题.中西医结合学报[J]，2003；1（3）：163-164.

永州市中医院湖南省永州市425000

【摘要】目的：探讨调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型腹膜淋巴孔密度及尿中Na+浓度的影响。方法：取S180细胞接种于小鼠腹腔造成肝癌腹水模型，随机分为空白对照组（NS）、模型组（M）、调营饮组（T），造模后第五天用调营饮汤剂连续灌胃，观察对小鼠腹膜淋巴孔密度的影响及及尿中Na+浓度。结果：T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01），T组尿Na+浓度明显大于NS组和M组，比较差异有显著性意义（P<0.05）。结论：调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，钠离子排出增多，可能是其消腹水作用机制之一。

【关键词】调营饮；S180；肝癌腹水；小鼠

Abstract：ObjectiveTostudyeffectofTIAOYINYINmixtureonconcentrationoftheperitoneallymphaticstomatainS180asciteslivercancermice，suchasdensityofdistribution.Methods：Thirty-twospecialpathogenfree（SPF）Kunmingmicewererandomizedinto3groups：blankcontralgroup（NS），modelcontralgroup（M），TIAOYINYINmixturemodelgroup（T），Makethemold5nddaystostartforthemedicine，after9ndmeasurethemice.Results：ComparedtoNSgroupandmodelgroup，TIAOYINYINmixturecouldsignificantlyenhancedensityofdistribution（P<0.05orP<0.01）.Conclusion：TheseexperimentstudyshowedTIAOYINYINMixtureregulatingperitoneallymphaticstomata，improvingthedrainagefromperitonealcavityinthemalignantascites.

[KEYWORDS]TIAOYINYINMixture，S180livercancerascites，mice

原发性肝癌（Primaryhepaticcancer，PHC）为常见肿瘤，腹水（Ascites）是肝癌常见的并发症之一；肝癌腹水中医学称之为”鼓胀”，又称“水蛊”、“蛊胀”、“蜘蛛蛊”等，被历代医家列为四大难证之一[1，2]。调营饮是治疗肝癌腹水的常用方，疗效肯定，现通过动物实验研究，探讨调营饮可能的作用机理。

1.实验材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物：健康昆明种小鼠36只，SPF级，雄性，4-6同周龄小鼠，体重20-24g，由湖南中医学院实验动物中心提供。

1.1.2实验试剂和仪器：调营饮汤剂由永州市中医院药剂科提供；台盼蓝液的配制：取苔盼蓝0.049g溶于双蒸水1Oml，过滤分装储藏于室温备用；湖南师范大学JSM-6360LV型电子扫描显微镜。永州市中医院检验科半自动生化析仪。

1.1.3瘤株：小鼠S180肝癌株由上海中科院细胞库所保种瘤株。

1.2方法

1.2.1造模

取S180肝癌细胞株，接种于健康昆明小鼠腹腔，取腹腔传代第8日小鼠，选择腹水饱满小鼠，脱颈椎处死，固定于蜡板上，腹部皮肤用碘酒、酒精消毒后，在超净台内于无菌条件下消毒鼠腹，抽取乳白色腹水为瘤源，将获取的活体腹水细胞用生理盐水1：3稀释，小心摇匀，然后用苔盼蓝染色，显微镜下计数存活瘤细胞数，并调整浓度到每毫升含有106个瘤细胞，存活率95%。用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到小鼠腹腔。全程严格无菌操作，40min内完成[3]。

1.2.2动物分组和给药：按照完全随机设计，遵照均衡性原则，先将小鼠按体重分层，然后查随机数字表将小鼠随机分成空白对照组（NS）、模型组（M）组、调营饮组（T），每组12只小鼠，用75%的酒精消毒实验小鼠腹部后，将肿瘤细胞悬液以每只0.2ml分别接种到除NS组的其它两组小鼠腹腔，造模后第5日，诊断性穿刺小鼠腹腔，如能抽取到腹水，证明造模成功。从造模后第5天开始NS组、M组以0.2mL/10g生理盐水灌胃，1次/d，连续5天，T组予成药0.03g/10g剂量灌胃[4，5，6]，1次/d，连续5天；平均每只小鼠每天给等量鼠料4g/（只?d）；一周换垫料2次，每日换新鲜水1次。

1.2.2观察指标及测定方法：

1.3.1尿Na+离子浓度测定

造模后第九天各组灌胃后，用自制代谢笼收集每组各小鼠2小时尿液，采用半自动生化析仪测定尿中Na+离子浓度。检测Na+采用６-氢氧化锑钾直接比浊法，原理如下：在分散剂和除干扰剂存在下，Na+与６-氢氧化锑钾在分散剂的作用下形成均一的浊度，在620nm波长下检测吸光度大小。简述操作程序如下：（1）分别向标准管、样品管加入试剂0.3ml（2）向标准管加入标准液20ul（3）向样品管加入样品20ul（4）分别向标准管、样品管加入促进剂200ul（5）形成混浊后各管加1ml乙醇稀释液，混匀后测定（6）半自动生化析仪用蒸馏水调零（7）620nm波长下检测吸光度，根据结果换算成Na+离子浓度。

做完尿液标本后拉颈处死小鼠，取小鼠右膈腹膜切成5mmx5mm，分别用2.5％戊二醛和1％娥酸双固定，2％单宁酸液导电处理，丙酮梯度脱水，醋酸异戊脂置换。HITACHC02临界点干燥仪处理，GTKOIB-5型离子溅射仪镀膜，JSM-6360LV扫描电镜观察，加速电压20kV，放大3500倍。数据测量用扫描电镜自带的smileview软件进行，在扫描电镜拍下的图片上测量淋巴孔密度（个/0.1mm2）[7]。

1.3.统计方法

应用SPSS15.0统计软件进行统计分析，实验数据用“”形式表示，结果之间多样本比较用F检验进行方差分析，组间均数两两比较用t检验，以P<0.05和P<0.01表示差异的显著性。

2.结果

2.1尿中Na+离子浓度

T组尿中平均Na+浓度明显高于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01）。结果见表1。

注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01；

2.1各组腹膜淋巴孔分布密度情况

T组腹膜淋巴孔平均密度均明显大于NS组和M组，差异有显著性意义（P<0.01），结果见表2。

注：与NS组比较*P<0.05，**P<0.01；与M组比较△P<0.05，△△P<0.01。

图1调营饮组（T组）实验小鼠第九天

图2调营饮组（T组）腹膜淋巴ⅹ3500倍

讨论

在我国，临床上大部分原发性肝癌是与乙肝病毒感染有关，90%以上合并肝硬化，腹水为终末期肝癌的典型临床表现，对大多数患者而言，缓解腹水引起的症状是治疗的主要目标[8]。目前临床采取的治疗方法较多，疗效有限，各有优缺点。现在采用中西医结合治疗恶性腹水，不但改善症状显著还能延长生存期，且副作用小，显示出其优势，是今后一个发展方向[8]。腹膜淋巴孔是腹膜毛细淋巴管在腹膜间皮上的开口，有主动的物质吸收功能。腹膜腔-腹膜淋巴孔-腹膜下小管和淋巴引流单位-淋巴陷窝-腹膜淋巴管-脉管系是腹膜腔内物质转归的直捷通路，也是巨噬细胞进入腹膜腔执行免疫功能的重要途径，在腹水的转归方面意义重大。

中医方面肝癌腹水的发生与感受湿热邪毒或长期饮食不节、嗜酒过度、七情内伤等引起机体阴阳失衡有关，形成气滞、血瘀、水停腹中，肝气郁结，气滞血瘀，是形成鼓胀的基本条件，脾脏功能受损，运化失职，遂致水湿停聚；肾脏的气化功能障碍，不能蒸化水液而加重水湿停滞，是形成鼓胀的重要因素，病位涉及肝、脾、肾三脏。在病机上由于本病本虚标实，虚实挟杂，调营饮为临床常用方，治予活血化瘀、行气利水。方中当归、川芎、赤芍等以活血化瘀；莪术、延胡索、大黄以行气活血；瞿麦、槟榔、葶苈子、赤茯苓、桑白皮等以行气利尿；陈皮、大腹皮、白芷理气消胀；细辛、肉桂温阳利水；炙甘草、姜、枣调和诸药。共奏活血化瘀、行气利水之功。

本实验研究显示：调营饮T组尿中平均钠离子浓度明显高于NS组和M组。血浆渗透压是影响组织液回流的一个重要因素，提高血浆渗透压有益于腹水的消除，其中降低Na+摄入、促进尿Na+排出、调整离子渗透压是消除腹水的一个重要手段。结果显示本方能使小鼠S180肝癌腹水模型尿中钠离子排出增加，减轻水钠潴留，可能是其消腹水作用机制之一。调营饮对小鼠S180肝癌腹水模型有明显促进腹膜淋巴孔开放，分布密度增加，T组腹膜淋巴孔密度明显大于NS组和M组（P<0.01）。腹膜淋巴孔密度改变，尿离子浓度的影响，可能与调营饮消腹水作用密切的联系，调营饮通过促进调节性媒介物质的释放，引起腹膜淋巴孔开放，尿离子的排出增加，从而引起小鼠尿量有明显增加，消腹水利尿作用十分明显。调营饮中是什么成分促进调节性物质的释放；其具体的机制是什么，有那些媒介物质参与其中，我们将在以后的实验中继续探讨，为其临床应用提供理论基础。

参考文献：

[1]华海青.原发性肝癌病机特点探讨[J].中国中医基础医学杂志，2004，10（2）：38-39

[2]周永兴.现代肝硬化诊断治疗学[M]．人民军医出版社，2008，52（3）：55-56

[3]盛庆寿.青蒿琥酯对S180肝癌小鼠的抑瘤作用及对肿瘤组织VEGF、FasL的影响[J].广州中医药大学学报，2008，36-39

[4]李仪奎.中药药理实验方法学第2版[M].上海科技出版社，1994，779-780

[5]陈谦，孙慧，李强等.医学实验肝癌动物模型的研究进展.中华实验外科杂志，2006：23（3）：377-378.

[6]徐静，李旭.肝癌动物模型的建立[M].实用肝脏病杂志，2005；8（2）：116-118

[7]李慧，李继承.腹膜淋巴孔研究的新进展[J].中国医学科学院学报，2007，22（6）：585-586

[8]吴孟超.中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题.中西医结合学报[J]，2003；1（3）：163-164.