超高效液相色谱在烟草化学分析中的应用

超高效液相色谱在烟草化学分析中的应用

蓝凯

江西中烟工业有限责任公司南昌卷烟厂江西南昌330096

摘要：对2000年至2017年期间超高效液相色谱法（ＵＰＬＣ）与光学检测器、质谱检测器联用测定烟叶原料、卷烟烟气、烟用材料等相关成分的应用进展作了评述，主要对色谱条件、前处理方法以及实际应用常见问题进行了讨论，并对目前ＵＰＬＣ技术使用的优势、不足及未来发展方向作了简要阐述。

关键词：超高效；液相色谱；烟草化学分析；应用

引言

高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）已在国内外多个分析领域广泛应用了３０年以上。经典的ＨＰＬＣ分析方法优点诸多，如操作方便、良好的选择性和灵敏度等。与气相色谱／毛细管电泳技术相比，ＨＰＬＣ流动相的低扩散效率（包括被分析物在固定相的低扩散效率）导致其检测效率较低。ＵＰＬＣ技术因其独特的优势，分析能力得到较大提高，在多个分析领域得到发展和应用。近年来，ＵＰＬＣ在烟草分析领域也得到了广泛应用，如烟气成分、烟叶成分、烟用香精香料、烟草香味物质、辅料等相关分析方面。其按照检测原理主要分为光学检测器和质谱（ＭＳ）检测器两大类。在光学检测方面，ＵＰＬＣ的开发多是基于成熟的ＨＰＬＣ演变而来，通常是将ＨＰＬＣ洗脱条件进行转换后，再根据试验情况进行微调，其优势在于待测组分可在短时间内获得理想的分离效果、更高的灵敏度，低于ＨＰＬＣ系统的检出限。在ＭＳ检测方面，主要是针对烟草中痕量成分检测（如亚硝胺），其基质复杂、背景干扰大。常规ＨＰＬＣ对该类物质准确定性定量较为困难，与串联质谱（ＭＳ／ＭＳ）联用可得到较可靠的分析结果。而超高效液相色谱－串联质谱法（ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）因其低流量、高分离度的特点更利于样品气化以及降低共流物导致的离子抑制，可使目标物的分析灵敏度更高，从而被广泛推广和应用。本文从ＵＰＬＣ与光学检测器和ＭＳ检测器联用展开综述和讨论，旨在为ＵＰＬＣ在烟草化学分析领域的应用提供参考。

1超高效液相色谱与光学检测器联用

1.1酚类化合物的检测

烟气中苯酚、邻／间／对苯二酚、邻／间／对甲酚等７种酚类化合物为强致癌性物质流量１．０ｍＬ•ｍｉｎ－１，梯度洗脱，分析时间４０ｍｉｎ，方法的检出限为６．４～２２．８ｎｇ•支－１，但存在间甲酚与对甲酚无法分离，甚至洗脱后为同一个色谱峰的问题。使用ＵＰＬＣ系统分别建立了上述７种酚类化合物完全分离的分析方法：通过在流动相中添加β－环糊精（β－ＣＤ），采用ＢＥＨＳｈｉｅｌｄＲＰ１８色谱柱（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，１．７μｍ），进样量４μＬ，流量０．３ｍＬ•ｍｉｎ－１，梯度洗脱；方法的回收率为９５．５％～１０３．５％，检出限为４～１４ｎｇ•支－１，分析时间为９．５ｍｉｎ。采用ＢＥＨＣ１８色谱柱（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，１．７μｍ），进样量１０μＬ，流量０．３ｍＬ•ｍｉｎ－１，梯度洗脱，方法的回收率为９０％～１０２％，检出限为０．０４～０．３５μｇ•支－１，分析时间为９ｍｉｎ。使用五氟苯基固定相色谱柱Ｋｉｎｅ－ｔｅｘＴＭＰＦＰ（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，２．６μｍ）省去流动相中添加β－ＣＤ的步骤，流量０．５ｍＬ•ｍｉｎ－１，梯度洗脱，可使间、对－甲酚得到完全分离；方法的回收率为８６．６２％～９６．８８％，检出限为０．０２～０．１２μｇ•支－１，分析时间为７ｍｉｎ。由以上方法可知：①ＵＰＬＣ所用的分析时间为ＨＰＬＣ的１／４左右，极大地提高了分析效率。ＵＰＬＣ分析方法较为类似，而采用大体积（１０μＬ）进样量达到更低检出限，表明增大进样量可有效地提高灵敏度，但由于ＵＰＬＣ色谱柱的体积小，进样量过大会使色谱柱过载，导致峰形展宽和灵敏度下降，需根据具体试验现象确定最佳进样量。通过筛选键合相，选择五氟苯基的色谱柱，可实现间甲酚与对甲酚的分离，省去了在流动相中添加β－环糊精的步骤，简化了方法；ＵＰＬＣ管路相对于ＨＰＬＣ管路更细，固体流动相添加剂使用不当易造成管路堵塞，简单的洗脱条件更利于ＵＰＬＣ的使用和维护。④ＵＰＬＣ的低流量减少了试剂排放，更经济环保。

1.2生物碱类的检测

卷烟烟气中的生物碱以烟碱为主，占生物碱总量的９５％以上。通常气相色谱法（ＧＣ）进行测定，分析时间６～８ｍｉｎ。建立了ＵＰＬＣ同时测定烟碱、可替宁、降烟碱、麦思明和新烟碱等５种生物碱的分析方法。该方法对比了不同提取溶剂超声提取烟末的效果，结果显示使用０．５％（质量分数）氢氧化钠－乙醇（１＋１０）混合液时提取完全。采用ＢＥＨＣ１８色谱柱（５０ｍｍ×２．１ｍｍ，１．７μｍ），流动相为乙腈和乙酸钠溶液体系，流量０．６ｍＬ•ｍｉｎ－１，梯度洗脱，可调波长紫外（ＴＵＶ）检测器于波长２５９ｎｍ处检测。

2超高效液相色谱与质谱检测器联用

2.1烟草特有亚硝胺的检测

烟草特有亚硝胺（ＴＳＮＡｓ）是卷烟烟气中的主要致癌物质之一，其在烟气中的含量很低，且烟气中基质复杂、化学成分较多，要准确定性定量分析ＴＳＮＡｓ难度较大。分析ＴＳＮＡｓ的常用方法为烟草科学研究合作中心（ＣＯＲＥＳＴＡ）推荐的气相色谱－热能分析法（ＧＣ－ＴＥＡ），分析时间约２６ｍｉｎ，方法的检出限为０．２４～０．７９ｎｇ•支－１。使用ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ系统建立了烟气中ＴＳＮＡｓ的分析方法，见表４。其中：文献［４８］方法中设置柱温６０℃，可消除Ｎ′－亚硝基降烟碱（ＮＮＮ）和４－（甲基亚硝胺基）－１－（３－吡啶基）－１－丁酮（ＮＮＫ）质子化后会存在异构体的现象，异构体相互转化会产生肩峰。由表４可见：①与ＧＣ－ＴＥＡ［４２－４５］相比，ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ的分析时间缩短了约２／３，且方法的检出限较低。使用的是全自动二维在线固相萃取（ＳＰＥ）－ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ系统，该方法的测定下限为目前报道方法中最低值，使用自动样品在线ＳＰＥ系统对样品进行提取、净化和富集，避免了人为操作中的耗时、耗力及不稳定因素，使用传统离线ＳＰＥ对样品进行净化虽然可以在一定程度上减小基质效应，但存在耗时长且处理样品数量有限等不足。以上方法的检出限差异较大，这主要是因为不同厂家的ＭＳ检测器原理和结构的差异、试验过程中的液相分离情况、ＭＳ检测器各参数的设置等均会影响方法的灵敏度和准确度。同时，使用ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ系统时需注意：虽然该系统无需实现各目标物的完全分离，可通过ＭＲＭ模式提取离子对实现各个目标物的准确定性定量，但共流出物会与目标物争夺电子，导致目标物带电不理想，从而影响方法的灵敏度。

2.2羰基化合物的检测

用２，４－二硝基苯肼处理过的剑桥滤片捕集烟气后，加入吡啶－乙腈溶液振荡提取，并加入内标进样，建立了ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ测定主流烟气中８种羰基化合物的分析方法。该方法采用电喷雾负离子模式（ＥＳＩ－）、ＭＲＭ模式，ＢＥＨＰｈｅｎｙｌ色谱柱（１００ｍｍ×２．１ｍｍ，１．７μｍ），流动相为乙腈溶液，流量０．２５ｍＬ•ｍｉｎ－１，梯度洗脱，方法的检出限为０．０８～０．２８μｇ•Ｌ－１，分析时间为１２ｍｉｎ。分析时间有所缩短，还利用ＭＳ检测器高灵敏度及高选择性的特点，解决了使用ＵＰＬＣ－ＰＤＡ系统对８种羰基化合物无法完全分离且有杂质干扰从而影响准确定量的问题。

结语

随着现代分析技术的不断发展、ＭＳ技术的日新月异，单一ＵＰＬＣ技术已不能满足当前分析领域的要求。近年来，ＵＰＬＣ和ＭＳ联用技术得到飞速发展，也进一步弥补了单一ＵＰＬＣ技术的不足，尤其是ＵＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ技术的发展。超高选择性和灵敏度的ＭＳ／ＭＳ技术与ＵＰＬＣ联用，很大程度上可以简化样品前处理过程，较为适合复杂基质中痕量成分的分析。高分辨率质谱（ＨＲＭＳ）技术的出现，进一步为目标分析物提供了更为精准而全面的数据，大大减小筛查和确证的误差，避免假阳性判定。ＵＰＬＣ作为一种新型分析技术的手段，具有其他检测方法无可比拟的优势，已应用在烟草化学分析领域的多个方面。随着现代分析技术的发展，ＵＰＬＣ与新型技术联用的研究和开发，为同时检测复杂基质中的痕量多组分提供了极具发展潜力的方向。如何建立灵敏度更高、提取范围更广、提取效率更高、操作更简单、更环保的ＵＰＬＣ分析方法依然是今后相关研究的重点。

参考文献

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