HIV分子生物学检测进展

HIV分子生物学检测进展

梁杰1王莉2杨献青1王飞1赵鹏1叶爱婷1黎俊宏3

（1.建德市疾病预防控制中心浙江建德311600；

2.江苏大学医学院卫生检验与检疫系江苏镇江201300；3.常州市疾病预防控制中心检测检验中心江苏常州213022）

摘要：分子生物学在艾滋病病毒（HIV）检测传染源中能起到早发现和早诊断的作用，而且可对HIV感染者的治疗效果进行评价，同时能对HIV感染者进行耐药性监测，降低艾滋病对人体和社会的危害。本文对分子生物学在HIV中的检测进展和HIV-1的分子生物学特性进行综述。

关键词：艾滋病；分子生物学；检测进展；HIV-1

MolecularBiologyDetectionProgressonHIV

LiangJie1，，WANGLi2，YangXian-qing，WANGFei，ZhaoPeng，YeAi-ting，LIJun-hong3*

1.JiandeCenterforDiseaseControlandPrevention，Jiande，Zhejiang311600，China；2.HealthinspectionandquarantinedepartmentofJiangsuuniversitymedicalschool，Zhenjiang201300，China；3.，InspectionCenter，ChangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention，Changzhou213022，China

Abstract：MolecularbiologycanhavetheeffectofearlydetectionandearlydiagnosisintheAIDSvirus（HIV），whichcanprovidethetherapeuticeffectevaluationanddrugresistancesurveillanceofpeoplelivingwithHIV.MolecularbiologycanreducetheHIV/AIDSharmtohumanbodyandsociety.ThispaperreviewstheHIVdetectionprogressofmolecularbiologyandthemolecularbiologicalcharacteristicsofHIV-1.

Keywords：AIDS；molecularbiology；detectionofprogress；HIV-1

获得性免疫缺陷综合征（Acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS）起因为人体免疫系统被HIV侵袭，使得人体免疫缺陷，引发多种感染性疾病。目前，因临床采用的检测方法灵敏度低，对AIDS早期检测造成不利。而以核酸检测为代表的分子生物学技术灵敏度和特异度高，均优于其它方法，且能大幅度缩短HIV检出窗口期。因HIV-1是艾滋病的主要病原体，现对HIV-1分子生物学检测进展进行综述。

1HIV-1生物学特性

HIV为直径100~120nm椭圆形或圆形的双层结构。类脂包膜构成其外层，其成分有外膜糖蛋白（gp120）与跨膜糖蛋白（gp41）；其核心则为RNA逆转录酶及蛋白质等成分。其基因组基本结构有基因长末端重复序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（pol）、包膜蛋白（env）等；其调节基因有nef、rev、tat、vif、vpr、vpu等，在转录、翻译、装配等方面对HIV的生长和繁殖起调节作用[1]。病毒衣壳在HIV核心外，膜蛋白处于病毒最外层，包膜上有刺突。env、gag和pol是HIV的3种结构蛋白，gag基因编码的核心蛋白都是在病毒的核酸蛋白体上面，p17的位置是在核蛋白和壳层之间的基质上面，包被在包膜蛋白的里边。p55、p40和p24构成的核衣壳包被在内部核酸的外围位置，p24为核衣壳的主要结构，是HIV-1型的特异性蛋白。包膜蛋白（env）为糖蛋白，gp160是前体分子，在感染初期产生，然后分解成gp120和gp41。聚合酶蛋白包括p66、p51、p31，它的位置在病毒的核区里边，并且和病毒核酸联系密切[2]。其功能为转录病毒RNA为DNA，整合病毒DNA到宿主细胞的DNA上，并切割前体分子使之成有活性的小分子。HIV-1型又分为M、N和O组，M组病毒是全球主要流行株，分为A、B、C、D、F、G、H、J、K共9个亚型[3]和15种流行重组模式（CRF01~CRF15），HIV-2分为6个亚型，不同地区和国家存在相对优势的HIV-1亚型，HIV-1亚型的研究在临床诊断、流行病学、试剂、药物和疫苗研发方面起着重要作用。

2HIV-1感染人体的机理

HIV进入人体内，在化学因子CCR5或CXCR4作用下，HIV表面gpl20与人的细胞表面受体CD4分子结合后，gp41协助HIV的外膜与人体CD4+细胞的细胞膜相融合，HIV核心蛋白和RNA进入人体细胞胞浆。逆转录酶作用于两条RNA+成DNA-，然后DNA多聚酶作用于DNA-复制DNA，部分DNA存留在人体细胞胞浆内产生一系列变化，并在人体细胞膜装配新的HIV，再感染其它人体细胞。人体感染HIV后，在人体内，HIVRNA最先能被检测到，p24抗原次之，最后是HIV抗体[4]。

3HIV分子生物学检测技术

近年来，分子生物学检测技术快速发展，在HIVRNA或DNA检测得到应用。核酸检测已是艾滋病实验室诊断的主要发展方向[5]，对HIV诊断、监测、疗效和预后判断等领域起着重要作用。目前，分子生物学在HIV中的检测主要分为定性和定量两类。

3.1定性检测

3.1.1原位杂交

以分子杂交法用特定的标记探针直接检测样本中HIV靶核酸，最开始的标记探针为放射性标记，后来发展为酶标记或化学发光标记等。原位杂交的阳性率略低于聚合酶链反应（PCR）相比略低，但核酸扩增技术的出现并得以广泛应用，原位杂交技术逐渐失去使用价值。

3.1.2PCR

PCR是建立在核酸生物学基础上的分子生物学诊断技术，其基本原理和DNA的天然复制过程相似，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR的三个基本步骤是变性、退火和延伸。人体感染HIV1-14天后，体内血浆可检出HIVRNA，常用于HIV急性感染期、HIV抗体检测不确定等情况的辅助检测或血液筛查；尤其在HIV抗体阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV的检测中，诊断准确性较高，前病毒DNAPCR法对出生48小时内的婴儿检测敏感性为38%，出生14天的婴儿检测敏感性为93%[6]。传统PCR需开盖取样电泳且方法敏感性极高，虽然操作简便，但易造成污染，出现假阳性结果。而且由于HIV基因多样性，目前尚无一套引物可将所有HIV序列覆盖，因此限制了检测的敏感性，且阳性结果还需经测序确认。HIV核酸定性检测阳性结果仅作为HIV抗体窗口期的早期诊断的辅助指标，不能单独用于HIV感染的确诊，成为限制PCR对于HIV感染诊断的临床应用。

3.1.3逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）

RT-PCR是利用RNA逆转录酶将病毒RNA逆转录为DNA，再进行PCR反应，指数扩增DNA片段，将PCR产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。RT-PCR的扩增产物在2小时内可达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，且对RT-PCR可进行准确的测量，已被许多商业实验室证实，现临床上多种改良的快速RT-PCR检测方法已应用于HIV的快速诊断中[7，8]。

3.2定量检测

HIV核酸定量检测即为HIV病毒载量测定，人体感染HIV后，病情发展速度与人体血浆中HIV病毒载量呈正比，目前常用的HIV核酸定量检测方法敏感性、特异性和可重复性较高。HIV核酸定量检测的意义：①早期辅助诊断，在其他血清学和病毒学标志出现前，检出病毒核酸，使窗口期缩短6-11.5天，且慢性潜伏期也能检出；也可判断无症状和血清HIV抗体阴性患者潜在的HIV传染。②评估病情病程、监测抗病毒治疗效果、病毒水平与抗病毒治疗方案的选择。③母婴诊断，鉴定婴儿出生后18个月内，其血液中HIVIgG抗体是否来源于母体，婴儿是否感染HIV。

3.2.1分支DNA信号扩大系统（bDNA）

bDNA是利用人工合成的带有侧链的DNA片段，其每个侧链上都可标记被激发的标记物，检测放大的靶信号获取定量结果。bDNA具有能较强的识别检测靶序列变异的优点。第三代具有靶序列放大系统的bDNA灵敏度更好，数十个探针覆盖整个基因组，有文献报道其为一种高灵敏度及特异性的HIV检测方法[9，10]，既能用于检测HIV感染和HIV部分变异株，在又能为疗效观察提供评价。bDNA与PCR相比，不存在扩增物的交叉污染，但灵敏度低于PCR，提高bDNA的灵敏度是尚需解决的难点。

3.3.2核酸序列依赖的扩增系统（NASBA）

NASBA建立在RT-PCR基础上，但不需分逆转录和PCR扩增，是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新检测技术，原理是提取较优的病毒RNA，加入AMV逆转录酶、核酸酶H、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。NASBA只需一个温度（42°C）即可扩增大量拷贝的RNA片段；适用于现场和实验室检测，一次扩增足量的RNA可进行多次研究，且可检测含肝素抗凝的血浆样品，可进行冻存血浆的回顾性分析；NASBA已用于HIV-1的分子诊断[10-12]。虽然NASBA具有高效扩增的特点，能结合多孔板酶介导的显像技术及实时荧光检测技术，但该法操作较繁琐，不适于大批量样本的检测，且扩增退火温度较低易污染。

3.3.3转录介导的扩增系统（TMA）

TMA原理与NASBA大致一样，不同在于TMA利用MMLV逆转录酶及T7RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性，反应温度为41.5°C，1小时内RNA模板扩增约达109，窗口期比p24抗原的检测缩短6天，比HIV抗体检测缩短14天[13]。

3.3.4连接酶酶促链式反应（LCR）

LCR是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相连接的探针扩增技术，其原理是由两段数十个核苷酸组成的单链DNA探针与目标序列杂交，扩增被检测物中的特异性片段，检测得到的扩增产物。LCR还可检测DNA突变，对于已知突变类型的基因诊断，LCR是可行有效的方法；LCR是一种继PCR后较有发展前景的新技术。

3.3.5实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术通常采用SybrGreen荧光染料或TaqMan探针，由于SybrGreen不能区别目的和非目的产物，结果存在偏差，特异性没有TaqMan好，故TaqMan得到广泛使用。荧光实时PCR的结果为S型扩增曲线，不仅可进行实时定性检测，尤为重要的是可进行定量检测。相比于常规PCR，具有特异性强、自动化程度高、有效解决污染问题等优点。荧光实时PCR能检测血浆中的病毒载量和血液中单个核细胞的前病毒载量；1996年美国PE公司发明TaqMan技术[14]，现已广泛应用于基因检测；我国国家药品监督管理局（SDA）于2002年4月批准了深圳匹基公司生产的国内第一个HIV荧光PCR检测试剂盒，并已在临床使用[15]；国产实时荧光PCR试剂检测HIV-1血浆病毒载量与进口试剂相比具有较好的相关性[16]，并具有价格低廉的优势，已在临床逐步推广应用。

3.3.6PCR-ELISA

PCR-ELISA基于PCR扩增后在微孔板上用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，采用酶标抗体，固相杂交来实现定量检测。PCR-ELISA具有灵敏度高和特异性强的优点，但ELISA是开放性的反应，PCR扩增后进行ELISA，更易造成污染引起假阳性，且操作复杂，临床上并未得到广泛的推广应用。

3.3.7基因芯片技术

基因芯片技术的原理是PCR与核酸分子杂交相结合，分析病毒基因组，以该病毒高度保守的序列作为鉴定指标，能直接检测病毒病原体，且诊断准确性很高[17]。上世纪90年代，Kozal等[18]研制出一种DNA芯片，能够筛选HIV-1逆转录酶及蛋白酶的基因突变，并对HIV拮抗药物的产生和突变、疾病相关基因型以及患者在治疗中的反应进行跟踪监测；Hauser等[19]则在艾滋病患者出现抗体反应前应用DNA芯片技术检测HIV，这对艾滋病的早期诊断具有重要意义。Affy-nletrix和RocheMo1ecular公司合作生产的新一代HIV诊断试剂盒，结合了PCR和DNA芯片技术，对艾滋病患者的HIV耐药反应进行检测，HIVPRT440也已广泛用于HIV-l病毒的测序、分型及多态性分析[20]。基因表达谱的研究可用于高通量检测基因表达信息[21]，国内也有文献报道采用基因芯片技术检测HIV[22，23]。因此，基因芯片技术在HIV感染的鉴定工作中具有其它方法无可比拟的优点。基因芯片技术还需不断完善和得以发展，但其未来的应用前景会十分广阔。基因芯片技术不只限于HIV耐药检测和基因诊断，而且可做到多种感染性疾病病原体基因集于一张芯片，并同时进行感染诊断。

4结语

HIV主要是侵袭人体的免疫系统，使得人体免疫缺陷，而引发多种感染性疾病；当前全球的艾滋病病情形势十分严峻，尤其是感染者中的15~24岁的青少年群体，高达一大半的占比，艾滋病严重影响了青少年群体的身体健康[1]。HIV尽早准确的被检出和艾滋病的诊断等环节在有效控制艾滋病广泛流行方面显得十分重要。由于目前临床上采用的检测方法灵敏度低，不利于HIV的早期检测。但伴随着检测技术的高速发展，以核酸检测为代表的分子生物学技术拥有诸多的优势，其灵敏度与特异性均得以显著提升，为HIV的早期检测提供了有利的条件。分子生物学检测技术在对HIV感染者的早发现、早诊断、早治疗具有较大的优势，对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测等方面都有重要作用，能够实现大幅减少艾滋病对个人、家庭、社会危害的目标。随着分子生物学检测HIV技术的不断发展和进步，在建立高特异性艾滋病诊断的标准、对HIV突变与个体遗传差异的检测和指导HIV抗病毒治疗以及遏止艾滋病人间的流行发挥着十分重要的作用。总之，将分子生物学技术应用于HIV感染者，能尽早发现艾滋病患者的存在，并及时开展艾滋病的治疗，对抗病毒药物的疗效评估、预测与监测疾病的进程有重要的意义，分子生物学技术在HIV中的检测值得在临床上推广并应用。

参考文献

[1]陈勤.HIV-1感染机体的分子生物学基础[J].现代医学，2004，4：7-9.

[2]邵一鸣，张健慧，陈刚，等.艾滋病病毒与艾滋病的发病机制[M].第2版.北京：科学出版社，2000：126-132.

[3]魏民，梁浩，陈健平，等.使用多重巢式PCR对我国HIV-1主要流行株亚型鉴定方法的建立[J].中华实验和临床病毒学杂志，2010，10（90）：12-13.

[4]ConstantineNT，ZinkH.HIVtestingtechnologiesaftertwodecadesofevolution[J].IndianJMedRes，2005，121（4）：519-538.

[5]WeberB，GurtlerL，ThorstenssonR，etal.Multicenterevaluationofanewautomatedfourth-generationhumanimmunodeficiencyvirusscreeningassaywithasensitiveantigendetectionmoduleandhighspecificity[J].JClinMicrobiol，2002，40（6）：1938-1946.

[6]沈霞.艾滋病的实验室诊断[J].中华检验医学杂志，2003，26：327-328.

[7]关琪，魏民，李鲁平，等.复合套式PCR鉴定HIV亚型的基因分型方法[J].中国公共卫生，2014，8（12）：33.

[8]普冬，赵勤，汪亚玲，等.巢式PCR方法检测艾滋病毒载量结果评估[J].实用临床医学，2008，9（12）：25-26.

[9]NolteFS.BranchedDNAsignalamplificationfordirectquantitationofnucleicacidsequencesinclinicalspecimens[J].AdvClinChem，1998，33：201-235.

[10]郭秋艳，黄晓婕，代丽丽，等.bDNA和NASBA法定量检测HIV-1病毒载量的比较研究[J].中国病原生物学杂志，2007，2：326-328.

[11]StevensW，HorsfieldP，ScottLE.EvaluationoftheperformanceoftheautomatedNucliSENSeasyMAGandEasyQsystemsversustheRocheAmpliPrep-AMPLICORcombinationforhigh-throughputmonitoringofhumanimmunodeficiencyvirusload[J].JClinMicrobiol，2007，45（4）：1244-1249.

[12]GottesmanBS，GrossmanZ，LorberM.ComparativeperformanceoftheAmplicorHIV-1monitorassayversusNucliSensEasyQinHIVsubtypeC-infectedpatients[J].JMedVirol，2006，78（7）：883-887.

[13]KolkDP，DockterJ，LinnenJ，etal.SignificantclosureoftheHumanimmunodeficiencyvirustype1andhepatitisCviruspreseroconversiondetectionwindowswithatranscription-mediated-amplification-drivenassay[J].JClinMicrobiol，2002，40（5）：1761-1766.

[14]DiamandisEP.Sequencingwithmicroarraytechnology-apowerfulnewtoolformoleculardiagnostics[J].ClinChem，2000，46（10）：1523-1525.

[15]马鹏飞，邢辉，魏民，等.国产实时荧光定量核酸检测试剂测定HIV病毒载量[J].中国艾滋病性病，2007，13：11-13.

[16]王佑春.国产艾滋病病毒检测试剂的发展状况[J].艾滋病检测实验室网络通信，2008，l（6）：2.

[17]魏民.实验室检测研究进展和发展趋势[J].国外医学（病毒学分册），2003，10：65-69.

[18]KozalMJ，ShahN，ShenN，eta1.ExtensivepolymorphismsobservedinHIV-1cladeBproteasegeneusinghigh-densityoligonucleotidearrays[J].NatMed，1996，2（7）：753-759.

[19]HauserMT，AdhamiF，DoruerM，eta1.Generationofco-dominantPCR-basedmarkersbyduplexanalysisonhighresolutiongels[J].PlantJ，1998，16（1）：117-125.

[20]VaheyM，NanME，BarrickS，eta1.PerformanceoftheAffymetrixGeneChipHIVPRT440platformforantiretroviraldrugresistancegenotypingofhumanimmunodeficiencyvirustype1cladesandviralisolateswithlengthpolymorphisms[J].JClinMicrobiol，1999，37（8）：2533-2537.

[21]Carcel-TrullosJ，StanleyJS，SahaR，eta1.Characterizationoftheglycosylationprofileofthehumanbreastcancercellline，MDA-231，andabonecolonizingvariant[J].IntJOncol，2006，28（5）：1173-1183.

[22]石向东，赵广录，王晓辉，等.HIV基因芯片在艾滋病母婴传播早期诊断中的应用[J].2005，32：639-641.

[23]黎志东，徐志凯.HIV亚型分析基因芯片的制备及应用[J].2003，17：164-166.