肺炎支原体及耐药多重RT-PCR检测试剂的研究

肺炎支原体及耐药多重RT-PCR检测试剂的研究

耿红

耿红(浙江省医疗器械研究所310009)

【摘要】目的：开发一次试验即可明确是否有肺炎支原体感染及所感染的肺炎支原体是否耐药的检测试剂。材料与方法：本试剂盒以PAGE纯化的引物、HPLC纯化的Taqman水解探针以及基因工程表达的热启动Taq酶作为主要扩增体系组分。结果：初步的临床实验结果证明，该试剂组分对痰液样本内肺炎支原体的检测灵敏度是94.93%，特异度是97.17%。结论：该试剂相关性能达到了国内临床诊断试剂所要求的主要性能指标。

【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）27-0158-03

肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae，MP）是一种常见的呼吸道病原体，通常导致轻微的上呼吸道感染，如喉咙痛、咽喉炎和气管炎[1]，其引起的肺炎占非细菌性肺炎的50%，还可引起肺外并发症，累及一个或多个系统、器官，如皮肤、胃肠道、心血管、骨骼肌肉和肾脏，严重时可致中枢和外周神经系统病变，甚至死亡。其潜伏期较长(2-3周)，而且传播率较低，导致流行期可持续1年左右，继而维持数年低发病率，3-7年后再出现流行高峰[2-3]。其主要通过飞沫以气溶胶形式传播，存留在鼻、喉、气管和痰液中，密切接触可能引起肺炎支原体的暴发[4]。肺炎支原体无细胞壁，因此，对影响细胞壁合成的抗生素如青霉素等不敏感，但是，对影响细菌蛋白合成的抗生素如大环内酯类、喹诺酮类等敏感[5]。因此，大环内酯类是治疗肺炎支原体感染的首选药物，它可结合于肺炎支原体核糖体50S亚基的转肽酶中心与肽输出通道之间的部分，通过机械阻塞通道而抑制肽链的延伸，从而达到抑制蛋白合成的目的，其结合位点由23SrRNA结构域Ⅴ的核苷酸构成，其中2063和2064位点是主要的组成部分[6-7]。近年来，随着大环内酯类抗生素的广泛使用，临床分离出了耐药菌株，提示肺炎支原体耐药现象的存在[8-9]。国内外的研究表明，产生耐药的肺炎支原体在23SrRNA序列上发生点突变，其中，最常见的是2063位点A到G的突变，2064位点A到G的突变[10]。

目前，临床上对肺炎支原体耐药性的检查，主要是依靠肺炎支原体的分离及药敏实验，由于肺炎支原体分离较为困难，所以灵敏度较低，而且耗时耗力，不利于及时指导用药[11]。本研究拟采用的荧光PCR技术，操作简便、检测迅速、检出率高，通过一次试验即可明确是否有肺炎支原体感染及所感染的肺炎支原体是否耐药，有利于对疾病进行及时诊断及合理选择治疗方案，与传统分离培养检测技术相比，提高了检出效率、降低了漏检率，有利于对疾病进行及时诊断及合理选择治疗方案，可对多种临床样本进行高效可靠的筛查，以及对临床病情和用药效果进行监测，指导合理用药。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1临床样本：病人的痰液样本。

1.1.2引物和探针：根据肺炎支原体标准株的P1基因与23SrRNA序列，从NCBI数据库下载目的基因片段序列，利用AlleleID软件设计多重扩增体系采用的引物探针，上海生工公司合成，其序列为：

（1）肺炎支原体（Mp）优选的引物和探针分别为：

上游引物

MpF:GGAATCCCAATGCACAAGAACA

MpF:TGTCTCTTCAAGGGATTCACCT

下游引物

MpR:GCTTTGGTCAACACATCAACCTT

MpR:TCTTGTTGCAATGATGAGGGTG

探针

MpP:5’FAM-CCTTGAAGGCTGGGTTTGCGCTA-BHQ13’

MpP:5’FAM-TGTCACTGCGGTTGTTGTGCCTACATCT-BHQ13’

（2）肺炎支原体2063（MpP1）和2064（MpP2）位耐药位点检测用引物探针：

上游引物MutF:GTGAAGACACCCGTTAGGC

下游引物MutR:ATTAGAACAGCACACAACCAAG

探针MpP1:5’ROX-ACGGGAAGACCCCG-MGB3’

探针MpP2:5’ROX-ACGGAGAGACCCCG-MGB3’

1.1.3试剂：TaqDNA聚合酶、UNG酶、MgCl2、dUTP、DMSO,总RNA提取试剂盒购自西安天隆科技有限公司。

1.2方法

1.2.1总RNA的提取

采用西安天隆科技的核酸提取试剂盒（磁珠法）进行抽提。

1.2.2RT-PCR反应

在25μl体系里进行一步法核酸扩增反应，反应溶液组成是：10×Buffer，2.5mMdNTPmix，DMSO，20μM探针和20μM引物，5U/μLHotStartTaq酶，UNG酶，最后，50℃，1个循环；95℃1min,1个循环；91℃，15s，64℃1min，40个循环，在64℃收集荧光。本试剂盒需要采用FAM、VIC和CY53种荧光进行实验，其中，CY5指示内标，FAM荧光指示肺炎支原体，VIC荧光指示肺炎支原体2063位或2064位核苷酸的突变。实验设备采用ABI7500。

2试剂盒的组装和验证

根据最佳反应条件，按照生产的要求对试剂盒进行组装，并对其检测肺炎支原体及耐药的效果进行验证。

2.1试剂盒的组装及操作

2.1.1试剂盒的组分

肺炎支原体核酸及耐药突变位点检测试剂盒（荧光PCR法）（16人份），包括以下组分：

2.1.2试剂盒的操作方法

2.1.2.1病毒RNA的提取

采用西安天隆科技的核酸提取试剂盒（磁珠法）进行核酸抽提。

2.1.2.2RT-PCR反应

（1）从试剂盒中取出MMBuffer、MMPP和水在冰上或4℃融化，取出EUmix，轻微摇晃混匀并低速简短离心。取出1个无菌无核酸酶的离心管，做好标记，每人份按照下表进行反应体系的配置，PCR反应的总数应为样本个数、2个阳性质控、1个质控品W、1个阴性抽提对照和1个PCR反应阴性对照的总和。

计算好各试剂使用量，加入适当体积离心管中，充分混匀，简短低速离心，向设定的荧光定量PCR反应管或96孔板中分别加入20.0µL，转移至样本处理区。

（2）在装有PCR反应液的PCR反应管中分别加入制备好的标本5.0µL（包括样本、强弱阳性质控、质控品W和抽提阴性对照），同时加5.0µL无菌水作为PCR反应阴性对照。将反应管放入荧光PCR检测仪中，循环参数设定如下：

荧光信号的收集定为FAM（2063或2064突变）、VIC（肺炎支原体）和CY5（内标），数据的采集定在64℃。

2.2试剂盒的验证

2.2.1试剂盒分析性能的研究

2.2.1.1试剂盒精密度的研究

临床检验结果表明，本试剂盒对痰液样本的检测特异度是97.17%。分析性能评估试验中，检测50份临床阴性样本和具有相似临床症状或者相同感染部位的病毒样本，结果呈100%阴性符合率。

2.2.1.2试剂盒突变最低检测限的研究

本试剂盒检测的是肺炎支原体包括2063和/或2064野生型及A:G耐药突变型的两种核酸，实际应用中，可能存在两种核酸同时存在的情况，针对此情况，进行突变最低检测限实验。

耐药突变检测采用重组质粒进行初步试验，合成2063位点发生A到G突变的质粒（记为2063）、2064位点A到G突变的质粒（记为2064）及2063和2064位点均发生突变的质粒(记为M129)，质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。Nanodrop测量质粒的浓度，将3种质粒分别稀释到10ng/μL，对每一混合样本进行稀释，分别进行5×102倍、1×103倍、5×103倍、1×104倍、5×104倍和1×107倍稀释后得到浓度分别是20pg/μL、10pg/μL、2pg/μL、1pg/μL、0.2pg/μL和0.001pg/μL的核酸，对此核酸重复检测3次，检测每一浓度下，2063位点或2064位点突变型能被检出的最低百分比。

2.2.1.3试剂盒灵敏度的研究

临床检验结果表明，本试剂盒对痰液样本的检测灵敏度是94.51%。以临床中浓度样本进行10倍梯度稀释，共稀释2个浓度梯度，检测各稀释梯度的Ct值，结果，当样本的Ct值大于34左右时，10次重复不能100%检出阳性。

2.2.1.4试剂盒荧光相互干扰的研究

采用肺炎支原体耐药突变阳性样本进行试验。将样本核酸分别置于单重PCR反应体系和多重PCR反应体系中进行扩增，看单重体系检测与多重体系检测Ct值之间的变异系数CV，CV≤10%，表示各荧光之间没有相互干扰。

实验结果表明，多重体系与单重体系检测结果之间的CV值在5.8%以内，表示没有显著差异，即各种荧光之间没有干扰。

2.2.1.5试剂盒准确度的研究

采用质控品质粒DNA稀释物进行试验，用核酸抽提试剂抽提后进行PCR检测，将检测结果与未抽提的质控检测结果进行比较。试验重复3次，计算抽提和未经过抽提的样品Ct值的平均值之间的变异系数，变异系数CV%≤10%表示两者之间没有差异，试剂盒的准确度高。结果表明，该试剂盒的变异系数在10%以内，准确度较高。

2.2.1.6试剂盒特异性的研究

用本公司生产的试剂分别在不同仪器上分别检测50份临床阴性样本，阴性符合率是100%，另检测具有相同感染部位或相似临床症状的病毒样本，结果显示较好的特异性。

2.2.1.7试剂盒抗干扰性能的研究

采用试剂盒对痰液样本中可能存在的干扰物质进行验证试验，实验中人为添加可能的干扰物质，将添加干扰物后的检测结果与没有添加干扰物的样本检测结果进行比较，看两者之间的变异系数CV，若CV%≤10%，则表示没有差异。结果表明，添加干扰物质后，FAM荧光的变异系数在2.30%以内，VIC荧光的变异系数在1.74%以内，CY5荧光的变异系数在5.80%以内，表示，干扰物对试验结果均没有显著影响。这说明试剂盒的抗干扰能力比较高。

2.2.2试剂盒分析性能的研究

2.2.2.1试剂盒实时稳定性的研究

将试剂盒置于-20℃冰箱中，分别于第0、2、4、6和第8个月取出，检测2份临床样本（肺炎支原体耐药突变阳性核酸）及内置强阳性质控品、弱阳性质控品和质控品W。用荧光定量PCR仪检测各样本的浓度，每一样本重复检测3次。将检测结果与第0个月的结果进行比较，看变异系数（CV），CV≤15%，表示没有差异。结果表明，试剂盒于-20℃冰箱中可至少存储8个月以上。

2.2.2.2试剂盒模拟运输稳定性的研究

试剂盒置于4℃，每24小时取出，共进行7天。每天进行强阳性质控品、弱阳性质控品、质控品W、2份肺炎支原体耐药突变阳性样本的检测，结果与存放0小时的结果进行比较，看变异系数（CV），若CV≤15%，表示没有差异。结果表明，试剂存盒于4℃可稳定贮存5天。

2.2.2.3试剂盒开瓶稳定性的研究

按照说明书，配制PCR反应液，置于4℃，间隔一定时间取样，共进行7天。每天对强阳性质控品、弱阳性质控品、质控品W、2份肺炎支原体耐药突变阳性样本进行检测，与存放0小时的结果进行比较，看变异系数（CV），若CV≤15%，表示没有差异。结果表明，开瓶后4℃存放时间的延长会导致检测结果Ct值靠后，最好现配现用。

2.2.2.4试剂盒37℃稳定性的研究

将试剂盒置于37℃，每24小时取出，配制PCR反应液并检测强阳性质控品、弱阳性质控品、质控品W、2份等浓度的野生型和2063突变型肺炎衣原体及2064突变型肺炎支原体的阳性样本等体积混合而成的样本，进行4天，检测结果与存放0小时的结果进行比较，看变异系数（CV），若CV≤15%，表示没有差异。结果表明，试剂盒37℃至少可以贮存到第4天。

2.2.2.5试剂盒冻融稳定性的研究

将试剂盒置于-20℃，每24小时取出，室温放置1h后-20℃存放，每天取样检测强阳性质控品、弱阳性质控品、质控品W、2份等浓度的野生型和2063突变型肺炎衣原体及2064突变型肺炎支原体的阳性样本等体积混合而成的阳性样本，共进行6天，检测结果与存放0小时的结果进行比较，看变异系数（CV），若CV≤15%，表示没有差异。结果表明，反复冻融7次对试剂盒无明显影响。

3结论与讨论

初步的临床实验结果证明：该试剂组分对痰液样本内肺炎支原体的检测灵敏度是94.51%，特异度是97.17%，单重体系检测与多重体系检测各种荧光之间没有干扰，检测具有相同感染部位或相似临床症状的病毒样本具有较好的特异性。初步的试剂盒稳定性实验结果表明：试剂盒于-20℃冰箱中可存储8个月以上；试剂盒存于4℃可稳定贮存5天；试剂盒37℃至少可以贮存到第4天；反复冻融7次对试剂盒无明显影响。

试剂盒精密度、灵敏度、准确度、抗干扰性能及各类稳定性研究的实验结果表明，该试剂相关性能达到了国内临床诊断试剂所要求的主要性能指标。

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