胡勒森竹岗八味丸微生物限度检查方法适用性试验

胡勒森竹岗八味丸微生物限度检查方法适用性试验

库尔班克孜·依斯拉木刘建明

库尔班克孜·依斯拉木刘建明

新疆博州食品药品检验所新疆博乐833400

【摘要】目的：建立蒙药制剂胡勒森竹岗八味丸的微生物限度检查方法。方法：按《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查法：微生物计数法和非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法进行适用性试验。结果：供试品5种试验菌回收比在0.5-2之间，控制菌均能正常检出。

【关键词】胡勒森竹岗八味丸；微生物限度；适用性试验

本文参考相关文献，根据制剂中成分的抑菌作用强度不同，采用了平皿法、建立了胡勒森竹岗八味丸相应的微生物限度检查方法，经方法适用性试验证实该方法简便易行，消除抑菌作用有效。

1.仪器与材料

1.1样品名称

胡勒森竹岗八味丸，批号：20180301、20181018、20190404均由新疆维吾尔自治区博尔塔拉蒙古自治州博乐市蒙医院生产。

1.2培养基及稀释液

胰酪大豆胨琼脂培养基（批号20190328）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（20190319）、肠道菌增菌液体培养基（批号170216）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号20190105）、麦康凯液体培养基（批号161228）、麦康凯琼脂培养基（批号150907）、RV沙门增菌液体培养基（批号20190309）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号170621）、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号20190129）。

1.3菌种

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、沙门氏菌[CMCC（B）50094]、黑曲霉[CMCC（F）98003]，均由中国食品药品检定研究院提供，工作菌抹为第3代。

2.菌液及供试液制备

2.1菌液的制备

取经35℃培养18-24小时的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌胰酪大豆胨液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的菌悬液；取经35℃培养18-24小时的大肠艾希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌胰酪大豆胨液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于100cfu/ml的菌悬液；取经25℃培养2-3天的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的菌悬液；取经25℃培养5-7天黑曲霉的新鲜培养物加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌数不大于10000cfu/ml的孢子悬液；

2.2供试液制备

取样品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，制成1：10的供试液；取1：10的供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50ml，制成1：50的供试液；取1：10的供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，制成1：100的供试液；取1：100的供试液10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至50ml，制成1：500的供试液。

3.需氧菌总数和霉菌及酵母菌总数计数检查方法适用性

供试液分别加入上述5种代表性实验菌株，再加15-20ml规定的琼脂培养基待凝固后，置规定温度培养24-72小时，观察结果，平板计数，测定回收比值。

3.1回收比值测定

试验组：取上述1：10、1：50、1：100、1：500供试液10ml加入0.1ml试验菌，混匀，取含菌供试液1ml分别注入无菌平皿中，立即相应的琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。需氧菌总数计数的试验菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌，相应的琼脂培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基；霉菌和酵母菌总数计数的试验菌株为沙氏葡萄糖琼脂培养基。供试品对照组：取制备好的供试液，不加菌液，按试验组计数方法，测定供试品本底菌数。菌液对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行测定其菌数。

测定结果显示：该供试品用1：10、1：50、1：100的供试品按平皿法对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌有明显抑制作用，回收比值小于0.5，采用1：500的供试品按平皿法对规定的菌株无明显抑制作用，回收比值在0.5～2之间，该供试品需氧菌总数计数可采用1：500供试液按平皿法测定，霉菌及酵母菌总数计数可采用1：10供试液按平皿法测定。

4.控制菌检查方法适用性

4.1菌液的制备

同计数方法适用性试验，控制菌菌液计数如下（见表1）：

4.2适用性试验

大肠艾希氏菌：取1：10的供试液10ml，加入大肠埃希菌菌液1ml，加入100ml胰酪大豆胨液体培养基，混匀，置35℃培养18小时，取上述培养物1ml接种至100ml麦康凯液体培养基中，42℃培养24小时。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上35℃培养18小时，麦康凯琼脂培养基应能检出大肠艾希氏菌反应特征。

耐胆盐革兰阴性菌：取样品1：10供试液100ml，置25℃培养2小时，取上述培养物10ml，加大肠埃希菌菌液、铜绿假单胞菌菌液各1ml，摇匀，接种至100ml肠道菌增菌液体培养基中，35℃培养24小时后，分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，35℃培养18小时，紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上应能检出耐胆盐革兰阴性菌的反应特征。

沙门菌：取供试品10g，加入200ml胰酪大豆胨液体培养基，沙门菌菌液1ml混匀，35℃培养24小时。取的上述培养物1ml，接种至10mlRV沙门增菌液体培养基中。35℃培养18小时，取少量RV沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，35℃培养18小时，木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应能检出沙门菌的反应特征。

4.3结果

本品控制菌检查方法为：大肠艾希氏菌，取样品1：10供试液10ml接种至胰酪大豆胨液体培养基中，培养基用量100ml；耐胆盐革兰阴性菌，取25℃培养2小时样品1：10供试液10ml，接种至肠道菌增菌液体培养基，培养基用量100ml；沙门氏菌，取样品10g，接种至胰酪大豆胨液体培养基，培养基用量200ml。

5.结论

按《中国药典》2015年版四部非无菌产品微生物限度检查法，进行三次独立适用性试验，试品5种试验菌回收比在0.5-2之间，控制菌均能正常检出。

参考文献：

[1]中国药典通则四部[M].北京：医药卫生出版社.2015.

[2]李趣嫦等.微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较[J].中国药品标准.2015，16.

作者简介：库尔班克孜·依斯拉木（1972.01-），女，维吾尔族，新疆博乐市人，本科学历，新疆博州食品药品检验所主管药师，主要研究方向：食药检验。