ADAM17对U87MG胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用机制研究

ADAM17对U87MG胶质瘤细胞增殖和侵袭中的作用机制研究

邹华元

（长沙市中心医院急诊科湖南长沙41004）

摘要：目的研究PI3K/AKT信号通路在ADAM17调控U87MG胶质瘤细胞增殖、侵袭中的作用机制。方法培养U87MG胶质瘤细胞，并建立ADAM17过表达组、ADAM17低表达组与抑制组，WesternBloting检测各组ADAM17、pPI3K、pAKT蛋白的变化，采用MTT法和Transwell侵袭实验分别检测各组U87MG胶质瘤细胞增殖情况和侵袭能力。结果ADAM17过表达组与抑制组的ADAM17水平明显高于ADAM17低表达组，差异具有统计学意义（P<0.01）；各组pPI3K和pAKT蛋白水平比较：ADAM17高表达组最高，ADAM17低表达组次之，抑制组最低（P<0.01）；各组U87MG胶质瘤细胞增殖情况比较：ADAM17高表达组最快，抑制组次之，ADAM17低表达组最慢（P<0.05）。各组U87MG胶质瘤细胞侵袭能力比较：ADAM17高表达组最高，抑制组次之，ADAM17低表达组最低（P<0.05）。结论ADAM17可能通过激活PI3K/AKT信号通路，促进U87MG胶质瘤细胞的增殖和侵袭。

关键词：ADAM17；U87MG胶质瘤细胞；侵袭；PI3K/AKT信号通路

胶质瘤是中枢神经系统中最常见且恶性程度最高的原发性肿瘤，由于其肿瘤细胞的高度侵袭性，导致胶质瘤患者的平均生存期均较短。故研究胶质瘤的相关致癌基因及其促进肿瘤增殖和侵袭的机制在改善患者的预后，延长生存期具有重要的意义[1]。U87MG胶质瘤细胞来源于IV期胶质瘤患者，具有很强的增殖、转移和侵袭能力。大量资料研究证实[2]：ADAM17是一种致癌基因，能通过激活EGFR的相关通道，参与了多种肿瘤细胞的侵袭过程，与肿瘤的迁移和侵袭密切相关。国内外学者研究亦表明[3]，胶质瘤组织和细胞中的ADAM17蛋白的表达水平明显高于正常脑组织，表明ADAM17与胶质瘤的发生发展关系密切。本课题前期研究证实ADAM17在促进U87MG胶质瘤细胞的增殖和侵袭中具有重要作用。故本研究将在前期研究的基础上，探讨PI3K/AKT信号通路在ADAM17调控U87MG胶质瘤细胞增殖、侵袭中的作用机制。现将结果报道如下：

1.资料与方法

1.1一般资料：收集2014年1月至2016年1月期间我院神经外科住院部胶质瘤患者，均为IV期胶质瘤患者，纳入标准：全部患者均符合胶质瘤的组织病理学诊断标准[4]，排除标准：术前放疗、化疗，合并肝肾功能障碍、心肺功能不全与精神性疾病患者。年龄18-79岁，平均年龄（47.36±5.69）岁。所有患者均签署知情同意书。

1.2细胞及其培养：将胶质瘤患者的U87MG胶质瘤细胞平均分为3组，并于用含10%的胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5%CO2培养箱内培养。第一组U87MG胶质瘤细胞转染ADAM17-siRNA72h，建立转染siRNA干扰基因敲除ADAM17的U87MG胶质瘤细胞，作为ADAM17低表达组，并将其于实验进行前1d接种于60mm的培养皿中。第二组U87MG胶质瘤细胞培养过程中，逐滴加入PMA，建立转染过表达ADAM17的U87MG胶质瘤细胞，作为ADAM17过表达组，并将其于实验进行前1d接种于60mm的培养皿中。第三组U87MG胶质瘤细胞培养过程中，逐滴加入PI3K抑制剂LY294002一小时后，加入PMA继续培养6h，作为抑制组，并将其于实验进行前1d接种于60mm的培养皿中。

1.3用Westernbloting检测各组ADAM17、pPI3K、pAKT蛋白的表达蛋白变化：收集细胞蛋白后，用BCA蛋白定量试剂盒测定目的蛋白的浓度，取上样量20ug的蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电压为120V，电泳时间为2小时，然后将目的蛋白的印迹转至PVDF膜上，并于室温下用5%脱脂奶粉进行封闭。一抗（1：1000）4℃过夜，二抗（1：2000）室温孵育一小时，并用ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，X胶片曝光并拍照。并利用凝胶成像系统在白光下对X胶片进行扫描，得到吸光度值。以肌动蛋白作为内参照，并以肌动蛋白的比值表示各组中ADAM17、pPI3K、pAKT蛋白的表达水平。

1.4用MTT法检测各组U87MG胶质瘤细胞增殖情况：将已转染的过表达ADAM17的U87MG胶质瘤细胞（ADAM17过表达组）与siRNA干扰基因敲除ADAM17的U87MG胶质瘤细胞（ADAM17低表达组），以及ADAM17过表达+PI3K抑制组（抑制组）的U87MG胶质瘤细胞，并将上述细胞消化成单细胞悬液，细胞计数，浓度1×105个/ml，置于96孔板，每孔100ul，即每孔细胞为1×104个，共18孔，经处理后加入MTT试剂（1：10），即100μl培养液加入10μl检测液，37℃，孵育4h后，并用酶标仪检测波长为490nm处的吸光值。

1.5用Transwell侵袭实验检测各组U87MG胶质瘤细胞侵袭能力：采用无血清的DMEM（1：8）试剂进行稀释，将已转染的过表达ADAM17的U87MG胶质瘤细胞（ADAM17过表达组）与siRNA干扰基因敲除ADAM17的U87MG胶质瘤细胞（ADAM17低表达组），以及ADAM17过表达+PI3K抑制组（抑制组）的U87MG胶质瘤细胞，进行消化并接种于24孔板内，取50μl加入Transwell孔板中，轻轻晃动，均匀铺满，于培养箱中进行干燥30min后再进行水化，并参照Transwell试剂盒（美国Fermentas公司）说明书操作。

1.6统计学处理：采用SPSS18.0软件对本研究的数据进行统计学分析，P<0.05，差异具有统计学意义。

2.结果

2.1各组ADAM17、pPI3K、pAKT蛋白的变化比较

ADAM17过表达组与抑制组的ADAM17水平明显高于ADAM17低表达组，差异具有统计学意义（P<0.01）；各组pPI3K水平比较：ADAM17高表达组最高，ADAM17低表达组次之，抑制组最低（P<0.01）；各组pAKT蛋白水平比较：ADAM17高表达组最高，ADAM17低表达组次之，抑制组最低（P<0.01）；见图1

图3各组U87MG胶质瘤细胞侵袭能力比较

3.讨论

ADAM17是去整合素-金属蛋白酶中的一种，具有水解细胞膜上的TNF-a的功能，亦称为TNF-a前体转换酶。国内学者研究表明：ADAM17能通过降解细胞外基质中的明胶和胶原等主要成分，增大细胞间质的空隙，从而为肿瘤血管的形成以及肿瘤的侵袭和转移提供有利的条件。同时，ADAM17亦能剪切脱落和活化的多种表皮生长因子受体的配体，激活EGFR的相关通道，引起级联反应，从而促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。胶质瘤组织和细胞中的ADAM17蛋白的表达水平明显高于正常脑组织[5]。U87MG胶质瘤细胞来源于IV期胶质瘤患者，具有很强的增殖、转移和侵袭能力。大量资料研究证实：EGFR的下游的相关信号通路PI3K/AKT在胶质瘤细胞的迁移和侵袭中具有重要的作用[6]。故本研究推测ADAM17可能通过激活PI3K/AKT通路来促进U87MG胶质瘤细胞的黏附、增殖、迁移和侵袭。

EGFR的下游的相关信号通路PI3K/AKT信号在U87MG胶质瘤细胞增殖中发挥重要的作用，与肿瘤的发生发展密切相关。本研究结果显示ADAM17过表达组以APM诱导ADAM17的表达增加，发现pPI3K、pAKT表达亦随之升高，U87MG胶质瘤细胞的增殖速率和侵袭能力均明显强于ADAM17低表达组和抑制组。同时ADAM17低表达组通过转染siRNA干扰基因敲除ADAM17后，ADAM17蛋白表达明显下降，pPI3K、pAKT表达亦随之明显降低，U87MG胶质瘤细胞的增殖速率和侵袭能力均明显弱于ADAM17高表达组和抑制组，提示ADAM17蛋白的表达对PI3K和AKT蛋白的表达有一定的调控作用，ADAM17蛋白和PI3K和AKT蛋白水平的改变能有效调控U87MG胶质瘤细胞的增殖速率和侵袭能力。本研究结果亦显示：抑制组在细胞中加入PI3K抑制剂LY294002一小时后，加入PMA继续培养，与PMA单独处理的细胞相比，pPI3K、pAKT表达明显降低，U87MG胶质瘤细胞的增殖速率和侵袭能力均明显弱于ADAM17高表达组，高于ADAM17低表达组。提示PI3K/AKT信号的下调对U87MG胶质瘤细胞的增殖和侵袭的影响显著，ADAM17调控U87MG胶质瘤细胞增殖和侵袭的过程可能是通过激活PI3K/AKT信号转导通路实现的。

综上所述，ADAM17蛋白的表达对PI3K和AKT蛋白的表达有一定的调控作用，且PI3K/AKT信号的下调对胶质瘤细胞的增殖和侵袭的影响显著，故ADAM17可能是通过激活PI3K/AKT信号转导通路实现对U87MG胶质瘤细胞增殖和侵袭过程的调控。

参考文献

[1]曾剑平，刘青，林志雄.脑胶质瘤患者预后相关影响因素分析[J].临床神经外科杂志，2015，0（6）；410-414

[2]刘爽.ADAM17在恶性肿瘤中的研究及其进展[J].现代生物医学进展，2013，2（17）；3386-3389

[3]呼铁民.ADAM17和EGFR在脑胶质瘤中的表达及意义[J].包头医学院学报，2015，31（8）；3-4

[4]RunCui，YanleiGuan，ChuanqiSun，etal.Atumor-suppressivemicroRNA，miR-504，inhibitscellproliferationandpromotesapoptosisbytargetingFOXP1inhumanglioma[J].CancerLetters，2016，374（1）：1-11.

[5]张艳，张雪鹏.ADAM17在脑胶质瘤中表达的研究[J].肿瘤学杂志，2013，12（4）；307-308

[6]孙晓阳，丁涟沭，金孝东.PI3K/Akt/mTOR信号传导通路与人脑胶质瘤恶性进展及预后的相关研究[J].中华神经医学杂志，2011，10（1）；24-28