葡萄糖调节蛋白78对口腔癌侵袭能力的影响

葡萄糖调节蛋白78对口腔癌侵袭能力的影响

张霄华尚德志※林风娇赵作栋

(沈阳医学院口腔医学院；辽宁沈阳110034)

口腔癌为世界范围内第六大常见之恶性肿瘤，口腔癌手术切除后容易局部复发和转移。葡萄糖调节蛋白78(Grp78)，Grp78可以激活易位到细胞其他部位，获得调控信号通路、细胞增殖、侵袭和转移、细胞凋亡、炎症和免疫等新的功能[1]。有研究显示，Grp78在肿瘤的侵袭和转移过程中发挥重要作用，本文应用siRNA技术和重组质粒转染特异性调节Grp78的表达，研究其对口腔癌的侵袭能力的影响。

【关键词】葡萄糖调节蛋白78；口腔癌；侵袭和转移

1材料和方法

1.1材料

细胞OSCC（上海细胞研究所）。siRNA-Grp78（上海吉凯基因化学技术有限公司）；抗GRP78、FAK单克隆抗体（鼠源）山羊源磷酸化FAK单克隆抗体，碱性磷酸酶标记的二抗（北京中杉公司）；Transwell（Costar）。

1.2方法

1.2.1细胞培养将OSCC细胞培养于RPMI-1640培养基中，放置在37℃、相对湿度90%、5%CO2的培养箱中培养，于次日进行培养基的更换后，继续培养。待细胞生长至培养瓶的80-90%，用0.25%胰蛋白酶进行消化传代。实验中采用对数生长期的细胞进行，倒置显微镜下观察。

1.2.2质粒构建和转染pcDNA3.1(+)-Grp78重组质粒的构建，通过将2kb人GRP78cDNA片段导入到pcDNA3.1(+)的HindIII和XhoL酶切位点。转染的前一天，细胞用0.25%的胰蛋白酶进行消化,然后在不含抗生素的培养基中将细胞接种至六孔培养板中,次日细胞长成为单层时进行转染。对照组在相同条件下，将空载体转染到细胞。采用免疫荧光技术检测转染效率。

1.2.3siRNA技术选择、设计及合成Grp78siRNA靶序列。细胞转染：采用Trans-MessengerTM将siRNA转染到OSCC细胞。加入RPMI-1640无血清培养基分别稀释2μgsiRNA和4μL转染试剂，再将两溶液轻轻混合，于室温下静置孵育20min。将混合物滴加入六孔培养板中，轻摇培养板以便充分混匀，然后置于37℃、5%CO2的培养箱中孵育5h。去除上述溶液复合物,并加入完全培养液置于培养箱中继续培养72h。免疫荧光检测GRP78的表达情况，观察转染效率。

1.2.4细胞划痕实验

如上所述，OSCC细胞经过siRNA及质粒转染的处理。在单层细胞中央做划痕，尽量保证各划痕宽度一致。于显微镜下拍照。

2结果

Grp78表达水平的变化可以有效影响口腔癌细胞的侵袭能力。划痕法实验结果表明，在24h后与对照组相比，Grp78-siRNA转染的OSCC细胞创口愈合程度明显较慢，而经pcDNA3.1（+）-Grp78转染后，Grp78表达升高的OSCC细胞，愈合程度则明显较快，分析结果显示差异具有统计学意义(P＜0.05)。这一结果表明，siRNA干扰后下调Grp78的表达水平，可以有效地抑制口腔癌细胞的转移能力，而Grp78过表达则可以提高口腔癌的转移能力。

3讨论

Grp78是一种-应激诱导的ER分子伴侣，Grp78的表达上调与肿瘤的演进及不良预后等具有相关性[2,3]。最近许多研究证实，Grp78的表达与不同类型的肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[4,5]。但目前为止，关于Grp78对口腔癌的侵袭和转移的影响及机制报道甚少。为探究Grp78是否参与到口腔癌的侵袭过程，本次实验通过小干扰RNA和质粒转染技术分别降低和增加Grp78的表达水平，实验结果显示，下调Grp78的表达抑制口腔癌的侵袭，而增加Grp78的表达可以促进口腔癌的侵袭。这表明，Grp78的表达水平在口腔癌的侵袭过程中发挥调节性作用。

参考文献：

1.RamosGdeO,B.L.,LauxenI,etal.,FibronectinModulatesCellAdhesionandSignalingtoPromoteSingleCellMigrationofHighlyInvasiveOralSquamousCellCarcinoma.PLoSOne,,2016,.11(3):p.e0151338.

2.NiM,Z.Y.,LeeAS,Beyondtheendoplasmicreticulum:atypicalGRP78incellviability,signallingandtherapeutictargeting.BiochemJ,2011.434(2):p.181-8.

3.Gonzalez-GronowM,S.M.,PapalasJ,etal,GRP78:amultifunctionalreceptoronthecellsurface.AntioxidRedoxSignal.,2009.11(9):p.2299-306.

4.SatoM,Y.V.,ArapW,etal,GRP78signalinghubareceptorfortargetedtumortherapy.AdvGenet,2010.69:p.97-114.

5.GrayPC,V.W.,Cripto/GRP78modulationoftheTGF-betapathwayindevelopmentandoncogenesis.FEBSLett,2012.586(14):p.1836-45

※通讯作者：尚德志沈阳医学院口腔医学院教授110034

本项目得到辽宁省教育厅科学技术研究项目支持L2014415和辽宁省大学生创业计划支持201310164006