结核分枝杆菌感染肺泡 II型上皮细胞的机体免疫应答的调控作用研究

结核分枝杆菌感染肺泡 II型上皮细胞的机体免疫应答的调控作用研究

1王晓平 刘静 肖慧霞 王晓林 王福锐

宁夏回族自治区第四人民医院参比室 宁夏，银川 750021

【摘要】 结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)引起的，主要感染先天免疫细胞。Mtb和先天免疫细胞早期相互作用较为复杂，本文就Mtb与免疫细胞的相互作用进行研究。

【关键词】 结核分枝杆菌；先天免疫细胞；免疫应答

基金项目：宁夏自然科学基金（2018AAC03201）

结核分枝杆菌（MTb）属于典型 的胞内寄生菌，是肺结核的致病菌。每年全球有数以万计的人都受到了结核分枝杆菌的感染。2015年，全世界共有1040万例新发结核病患者，大约180万例死于结核病，其中40万例感染了艾滋病病毒。结核分枝杆菌是引起结核病的病原菌，其感染机制不仅与巨噬细胞存在密切关系，而且人们开始意识到肺泡上皮细胞在结核分枝杆菌中起着重要的作用[1] [2]。

结核分枝杆菌通过呼吸道侵入机体，引起肺结核，如果没有被及时清除，就会在巨噬细胞中繁殖，使得机体呈原发性结核或者潜伏性感染。过去大量研究都关注在结核分枝杆菌与巨噬细胞之间的相互关系，最近人民开始意识到肺泡上皮细胞在结核分枝杆菌中起着重要作用。肺泡II型上皮细胞是一组具有多种功能的肺泡保护性细胞，在天然免疫中发挥重要作用[3]。最近研究表明肺泡II型上皮细胞具有杀菌作用。结核分枝杆菌不仅可以入侵进入上皮细胞，而且还可以复制，并且有着比在巨噬细胞内复制更高的能力。它可以刺激上皮细胞分泌各种细胞因子，从而产生细胞毒性，促进结核分枝杆菌的传播和结核病的发生和发展。巨噬细胞作为机体抵抗外源病原体的第一道屏障，承担着机体对结核分枝杆菌进行免疫调节免疫清除及维持宿主稳定的主要反应细胞[4] [5]。

一、菌株来源

结核分枝杆菌标准菌株H37RV，BCG由本室保存。结核分枝杆菌的相关操作都在II级生物安全实验室内完成。

二、仪器及耗材

PCR仪器、超低温冰箱、LED荧光显微镜、高压灭菌器、GENEXPERT检测仪、恒温培养箱、生物安全柜、线性探针检测仪等。

1.5毫升离心管，15毫升离心管，50毫升离心管，10微升枪头，100微升枪头，1毫升枪头，8联管，3毫升一次性吸管。

五、实验方法

结核分枝杆菌标准株及结核分枝杆菌实验株，用一次性吸管接种至酸性罗氏培养管中，大概接种2滴（20微升），轻轻旋转铺满整个平面，放置37度恒温箱，大概2周左右长出肉眼可见菌落。备用。

将结核分枝杆菌从罗氏培养基上刮下来，然后放入到无菌生理盐水中，漩涡震荡混匀，离心，弃上清,加入DNA提取液，然后金属浴10分钟后，超声15分钟。离心，取上清进行PCR 扩增。

10μl 体系如下：

荧光定量PCR检测：所得DNA取5微升上机荧光定量PCR检测。

六、实验结果

1、巨噬细胞识别吞噬MTB

机体感染MTB后，局势细胞首先通过细胞表面的模式识别受体识别结核分枝杆菌的相关模式分子并吞噬病原体。CLR主要识别结核分枝杆菌细胞表面的糖基化配体来调控吞噬作用，NRL受到外源性刺激后可激活NF-kB或丝裂原化蛋白激酶信号通路[6]。

2、结核分枝杆菌引起的机体免疫反应

在感染初始阶段分枝杆菌主要由宿主肺泡巨噬细胞和II型肺泡上皮细胞摄取，引起先天性免疫，巨噬细胞和DC细胞在抗原递呈过程中发挥着重要的作用，巨噬细胞抗原分泌细胞因子激活T细胞和B细胞介导的特异性免疫[7]。

3、结核分枝杆菌诱发巨噬细胞的炎性反应

巨噬细胞作为机体抵抗外源病原体感染的第一道屏障，承担着机体对结核分枝杆菌进行免疫清除及维持宿主稳定的主要效应细胞，肺泡巨噬细胞在感染过程中通过吞噬作用杀伤外源性微生物。巨噬细胞可通过表达多种模式识别受体识别多种侵入的外源病原体。在感染初期，结核菌被吞噬细胞吞入，成为康结核菌感染的第一道防线，而巨噬细胞和树突状细胞被认为是抑制细胞内结核分枝杆菌繁殖的重要机制之一[8]。

4、结核分枝杆菌诱发肺泡上皮细胞的炎性反应

肺泡上皮细胞占据了肺脏99%的表面积，是支持体内氧气与二氧化碳交换最基本的细胞结构，先天免疫系统提供着最原始的保护作用以抵抗微生物的侵入以及刺激机体获得免疫反应。作为外源微生物受体TRLRs信号同样存在于呼吸道上皮细胞中，启动并刺激机体做出适当的免疫反应。肺泡上皮细胞在结核分枝杆菌感染过程中也起着不可或缺的作用[9]。

七、总结

机体感染结核分枝杆菌后，巨噬细胞既可激活天然免疫信号通路参与杀伤病原菌，又可通过加工提呈抗原启动获得性免疫。近年来相关的研究也有增多的趋势，进一步研究巨噬细胞在抗结核感染中的防御机制及同结核分枝杆菌至今的复杂关系，有助于新型抗结核免疫制剂的研发，也更全面的了解为有效的宿主定向治疗或辅助治疗提供新的潜在目标。

参考文献

[1] 陈伟，傅衍勇．我国耐药结核病控制的现状与展望．结核病与肺部健康杂志，2016，5(4)：259—261．

[2]范晓萍，张文宏．广泛耐药结核分技杆菌耐药机制及其疾病诊断的研宄进展．微生物与感染，2011，02)：ll 7-121．

[3] Wu J，Wang S，Lu C，et a1．Multiple cytokine responses in discriminating between active tuberculosis and latent tuberculosis infection．Tuberculosis(Edinb)，2017，102：68—75．

[4] 春辉，杜先智．维生素D诱导自噬对巨噬细胞清除结核分枝杆菌的作用．中国免疫学杂志．2015，31(4)：456 461．

[5] 乃望，余荣环．肺巨噬细胞研究的现状及进展[J]．国际呼吸杂志，2018，38(5)397—400．DOI：10．3760／cma．jissn．1673—436X．2018，05．017．

基金项目：宁夏自然科学基金（2018AAC03201）

1 基金项目：宁夏自然科学基金（2018AAC03201）。

作者单位：750021银川，宁夏回族自治区第四人民医院结核病 参比室 。

通信作者：王晓平，Email：biowxp@163.com