Bcl-2核酶诱导SMMC7721细胞凋亡与p16,p21蛋白表达的关系研究

摘要：目的　观察bcl-2核酶对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞的作用,并检测p16和p21的表达情况。 探讨bcl－2核酶在肝癌治疗中的意义。方法 经脂质体介导的方法，将PMTr－neo(正向bcl－2核 酶真核表达载体)导入SMMC7721细胞中。细胞克隆转移扩大培养后,采用TUNEL法、免疫组化技术结 合图像分析，在检测SMMC7721/PMTr－neo细胞凋亡的同时，检测p16, p21的表达。结果与对照组相比较 ,在 bcl－2核酶诱发SMMC7721细胞发生凋亡的同时,p16和p21基因的表达水平显著增高。 结论　bcl-2核酶通过封闭bcl-2的表达可促进SMMC7721细胞凋亡,同时伴发p21和p16表达水平的增高。

Relationship between apoptosis induced with bcl-2 ribozyme and expression of p16, p21 in SMMC7721 cells

　　Abstract: Aim To observe the effect of bcl-2 ribozyme on SMMC7721 cells and the expression of p16, p21,so to investigate the role of bcl-2 ribozyme in hepatocarcinoma treatment. Methods PMTr neo (sense bcl-2 ribozyme eucaryotic expression vector) was introduced into SMMC7221 cells through lipofectin mediation. After cloning, TUNEL and IHC in combination with imaging analysis were used to simultaneously determine apoptosis and p16, p21 expressions of  the SMMC7721/PMTr neo cells. Results Compared with control, in the course of apoptosis induced by bcl-2 ribozyme p16 and p21 expressions rose significantly in SMMC7721 cells. Conclusion bcl-2 ribozyme can promote SMMC7721 cell apoptosis by blocking bcl-2 expression, which is accompanied by an increased p16 and p21 expressions. This result could be of value for studying hepatocarcinoma genesis and probing therapeutic procedure. neo (sense bcl-2 ribozyme eucaryotic expression vector) was introduced into SMMC7221 cells through lipofectin mediation. After cloning, TUNEL and IHC in combination with imaging analysis were used to simultaneously determine apoptosis and p16, p21 expressions of the SMMC7721/PMTr neo cells. Results Compared with control, in the course of apoptosis induced by bcl-2 ribozyme p16 and p21 expressions rose significantly in SMMC7721 cells. Conclusion bcl-2 ribozyme can promote SMMC7721 cell apoptosis by blocking bcl-2 expression, which is accompanied by an increased p16 and p21 expressions. This result could be of value for studying hepatocarcinoma genesis and probing therapeutic procedure.

　　Keywords: hepatic carcinoma; bc l-2; ribozyme; p16; p21▲

　　抗凋亡蛋白bcl-2在肿瘤发生过程中具有着重要的意义。自从Vaux首次提出bcl-2高表达可诱发肿瘤后，人们深入研究发现，bcl-2可延长细胞的生存期,抑制细胞凋亡〔1－3〕。人们已对bcl-2与肝癌的关系进行了探讨,认为它与肝癌的发生存在密切的关系。我们应用脂质体介导的基因转移方法，将bcl-2核酶导入人肝癌细胞株SMMC7721细胞中,并结合TUNEL原位杂交法和免疫组化等技术，观察了bcl-2核酶对SMMC7721细胞的影响,同时检测了bcl-2,p16,p21的表达情况。目的在于研究bcl-2核酶对肝癌细胞的作用机制,并探讨bcl-2,p16和p21在肝癌发生中的意义,为肝癌的治疗提供理论依据。

　　1　材料和方法

　　1.1材料大肠杆菌JM109由本校生化教研室惠赠；质粒PMTrneo由彭玮丹博士惠赠〔11〕。核酸内切酶购自Promega公司。脂质体转染试剂盒购自Gibico公司；凋亡检测试剂盒购自BoehringerMannheim公司。免疫组化试剂盒EnvisionTM＋System,HRP,mouse(R4001)购自Dako公司。SMMC7721细胞由本室保存培养。

　　1.2方法

　　1.2.1质粒PMTrneo的鉴定及转染细胞以质粒PMTrneo转化大肠杆菌JM109，扩增、提取质粒，经核酸内切酶BamHI和EcoRI双酶切后,电泳鉴定bcl-2核酶片段的大小。把处于对数生长期的SMMC7721细胞分为两组:对照组(SMMC7721细胞)和实验组(转染PMTrneo的7721细胞)。转染方法按脂质体转染试剂盒中的说明书操作步骤进行。培养48h后，传代、加入含G418550mg/L的培养液，筛选抗性细胞。继续培养2wk后，可见细胞克隆形成。

　　1.2.2SMMC7721/PMTrneo细胞的鉴定细胞克隆扩大培养后,制作细胞爬片,加入100μmol/L硫酸锌，诱导bcl-2核酶表达。爬片经丙酮固定后，以免疫组化法检测bcl-2的表达情况。所用抗bcl-2、

　　单抗(mAb)购自中山生物公司。免疫组化的步骤如下：(1)以30mL/LH2O2－甲醇封闭30min；(2)再以30g/LBSA封闭30min；(3)加一抗(抗p16，抗p21和抗bcl-2mAb)4℃过夜；(4)加HRP抗鼠IgGABC复合物(Dako公司产品);(5)显色、苏木精衬染。以上各步骤均用0.01mol/LPBS缓冲液洗涤，光镜下观察结果。

　　1.2.3bcl-2核酶的诱导表达SMMC7721/PMTrneo细胞克隆转移扩大培养后，加入硫酸锌100μmol/L诱导bcl-2核酶表达。24h后换液，继续培养3d后，分别检测细胞凋亡及p16和p21的表达。

　　1.2.4bcl-2核酶的促凋亡作用(1)原位爬片的TUNEL原位杂交检测：检测凋亡方法的步骤参照原位细胞凋亡检测试剂盒说明书进行，简述如下：①细胞爬片用多聚甲醛室温固定30min；②加1mL/LTritonX100和1g/L枸椽酸钠4℃2min；③加TUNEL反应混合液50μL，37℃60min；④加碱性磷酸酶转换液50μL，37℃30min；⑤加50μL底物液，室温10min。以上各操作步骤均用0.01mL/LPBS洗涤，光镜下观察结果。在高倍视野下计数200个细胞，计算凋亡细胞所占数量的百分比。(2)p16和p21的免疫组化检测：所用抗p16和抗p21单抗(mAb)均购自中山生物公司。免疫组化的步骤同1.2.2中所述。光镜下观察结果。在高倍视野下计数200个细胞，应用HPIAS1000图文报告管理系统进行处理，检测细胞的平均光吸收(A)值。

　　2　结果

　　2.1TUNEL原位杂交检测光镜观察可见凋亡细胞胞浆减少、体积变小、固缩，阳性信号呈深蓝色、团块状分布于细胞内或细胞核中。SMMC7721/PMTrneo细胞较对照组细胞的凋亡数量显著增多(图1)。在高倍视野下，选择5个视野分别计数200个细胞，计算凋亡细胞所占百分比。发现SMMC7721/PMTrneo细胞组凋亡细胞 为24±4/200(12％)，比对照组(8±3/200,4％)明显增多，统计学检验表明，发生凋亡的细胞数量在两组细胞之间有显著的差别(P∨0.01，2=7.643)。 　2.2免疫组化检测光镜观察bcl-2，p16和p21蛋白主要分布在细胞浆中，p16和p21蛋白也可分布在细胞核中，阳性信号呈棕黄色颗粒。在SMMC7721/PMTrneo细胞中，未能检测到bcl-2蛋白，而对照组bcl-2结果为阳性，说明在Zn2＋诱导下bcl-2核酶有效表达,在转录水平上封闭了bcl-2mRNA的表达。免疫组化检测p16和p21蛋白的表达发现，在对照组细胞中p16和p21的表达呈弱阳性，且阳性表达细胞数少，分布散在；而在SMMC7721/PMTrneo细胞中p16和p21的表达呈强阳性，且阳性表达细胞数多、分布均匀(图2)。图像分析测定两组免疫组化染色中p16，p21阳性细胞的A值，SMMC7721/PMTrneo细胞组分别为：0.23±0.06，0.26±0.02；对照组分别为：0.18±0.02，0.19±0.03。SMMC7721/PMTrneo细胞组较对照组细胞表达p16和p21蛋白的水平显著增高，统计学检验表明，p16和p21的表达程度在两组细胞之间均有显著的差别(P均∨0.05)，提示通过转染bcl-2核酶抑制bcl-2表达后,p16与p21的表达水平有明显的增加。

　　3　讨论

　　抗凋亡基因bcl-2是肿瘤研究中最受关注的癌基因之一。研究发现，bcl-2过量表达可阻断多种刺激引起的细胞凋亡，延长细胞的生存期；抑制bcl-2的表达，可在多种肿瘤中引起细胞凋亡〔1－3〕。对凋亡调控的研究发现，bcl-2的抗凋亡作用主要是通过竞争性形成不同的二聚体形式而发挥作用〔4－5〕。例如，bcl-2与bak结合成杂交二聚体，便可以抑制bak的促凋亡作用。最近研究还表明，bcl-2可阻止细胞进入细胞周期及引起细胞对化疗药物的抗性。因此，对bcl-2更深入地研究具有重要的意义。本实验将带有锤头状bcl-2核酶的可诱导的真核表达载体〔11〕，通过脂质体介导方法转入SMMC7721培养细胞中,通过bcl-2核酶来阻断bcl-2基因表达。结果表明，转染bcl-2核酶的SMMC7721细胞表达bcl-2的水平显著下降。用免疫组化法未能检出SMMC7721细胞中有bcl-2蛋白；用TUNEL原位杂交方法检测到转染细胞发生显著凋亡。有关bcl-2核酶对肿瘤细胞的促凋亡作用，文献报道结果不一。Dorai等〔6－7〕观察到bcl-2核酶对前列腺癌细胞有明显的促凋亡作用；而有人发现bcl-2核酶对慢性髓细胞白血病细胞无明显的促凋亡作用〔8〕。我们的实验结果与Dorai等的结论相似，说明bcl-2核酶对肝癌细胞有一定的促凋亡作用，验证了bcl-2抑制凋亡的作用。同时我们观察到，转染bcl-2核酶的细胞中p16和p21的表达水平增加。p16和p21均在细胞周期调控表达中起重要作用，均属于细胞周期蛋白激酶抑制蛋白，对G1/S转换起负调节作用〔9－10〕。p16和p21通过影响CDK的活性可阻止细胞进入S期；p21在转录水平还受P53调控。因此，可以推测bcl-2核酶封闭bcl-2基因表达后，可引起p16和p21表达水平的增加，进而可能会影响细胞周期调控，G1/S期转换受阻；同时，由于bcl-2基因表达受抑或降低，相对表达增加的p53可上调p21表达，加剧细胞凋亡。由于对bcl-2核酶进入细胞后的表达情况不清楚,我们推测，通过转染bcl-2核酶抑制bcl-2表达后,p16与p21表达水平的增加可能是继发性的，对此有待于更深入地研究。■

　　作者简介：张传山，男，33岁，博士生西安市长乐西路17号 ，Tel.(029)3374541-115(O) 2000 by J Cell Mol Immunol Press www.immunology. net/jcmi; Email. immuedit@fmmu.edu.cn

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