地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

【摘要】  目的建立和优化地龙ISSR－PCR反应体系。方法以地龙药材为实验试材，采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板，对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选。结果建立了标记位点清晰、稳定、重复性好，可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系，50 μl体系中含有：1×Taq酶配套缓冲液，DNA模板50 ng，2.5U Taq DNA聚合酶，2 mmol／L MgCl2，0.8 μmol／L引物，0.2 mmol／L dNTPs。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，（据不同引物的退火温度）复性30 s，72℃ 延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸5 min，反应结束后，4℃保存。结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础。

【关键词】  地龙；ISSR；反应体系；建立和优化

　　Establishment and Optimization of ISSR-PCR Reaction System for Earthworm

　　WU Wen　ru, LI Wei

　　College of Pharmacology, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou, Guangdong,510006, China

　　Abstract:ObjectiveTo establish and optimize ISSR-PCR reaction system for earthworm. MethodsEarthworm DNA was extracted by isopropyl alcohol extraction method. Single and double factors experiment methods were used to present the effect of the main reaction system elements(Taq DNA polymerase，template DNA，Mg2+，primer，dNTPs) and annealing temperature on ISSR-PCR．ResultsA reaction system and amplified procedure suitable for earthworm were established，that was，50 μl reaction system containing 1×PCR buffer，50ng template DNA，2.5U Taq DNA polymerase, 2   mmol／L MgCl2, 0.8 μmol／L primer， and 0.2 mmol／L dNTPs. The optimal amplified procedure was as follows：after a predenaturing of 5 min at 94℃ ，35 cycles were performed with denaturing of 30 s at 94℃，annealing of 30 s according to denaturing temperature of different primer，extension of 1.5 min at 72℃，a final extension step of 5min at 72℃ and hold at 4℃．ConclusionThis optimal system lay the standardization program for the identification of earthworm and the genetic persity analysis of its germplasm resource．

　　Key words:Earthworm; Inter Simple Sequence Repeat； Reaction system；Establishment and optimization

    地龙为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum(E Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris（Chen）、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera（Michaelsen）的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”，为常用动物类中药，具有清热定惊、通络平喘、利尿的功效。地龙类药用原动物品种较多，目前生药鉴定所采用的方法，大多仍沿用传统的经典分类方法，通过活体性状［1］或者粉末显微特征的观察［2］来鉴别。对于经过炮制加工了的药材，因为失去其原本性状而难辨真伪，也有人尝试用一些新技术和新方法来解决这一难题，如用X射线衍射Fourier谱对广地龙药材粉末进行了鉴定新方法摸索［3］,利用高效液相色谱法对地龙药材进行指纹图谱分析［4］等。但这些方法并未被得到广泛的使用，且存在结果的专属和可靠性等问题。

   
　　简单重复序列区间(inter-simple sequence repeat,ISSR)是Zietkiewicz［5］等于1994创建的一类在PCR反应基础上的DNA分子标记技术，它是根据基因组内广泛存在的微卫星序列设计的单一引物对基因组进行扩增的标记系统，近年来该技术已迅速应用于品种鉴定［6］、种质资源和遗传多样性［7］的研究，并作为构建遗传连锁图谱的工具［8］。ISSR技术与RAPD技术相似，其缺点是对不同引物、不同材料的扩增条件有异，PCR扩增反应的最佳条件需要一定时间的摸索。在扩增条件中，模板DNA的量、引物浓度、镁离子浓度和Taq酶的量、引物退火温度等都会影响ISSR扩增。 本研究探讨地龙ISSR-PCR反应的优化条件，以期建立可用于地龙ISSR－PCR分析的最佳反应体系和扩增程序，为深入开展地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定基础。

　　1 器材

　　1.1 仪器

　　Eppendorf5410R型台式高速冷冻离心机；TaKaRa TP600梯度PCR；凝胶电泳仪：北京六一仪器厂DYY-6C型；凝胶图像分析系统：英国UVP公司GDS7600；多功能酶标仪：TECAN Spectra FLUOR plus。

　　1.2 材料

　　Taq DNA聚合酶、dNTPs及2000bp DNA Ladder marker购自广州美津公司；ISSR引物根据加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列，由上海生工生物工程公司合成，经初步筛选，确定UBC834序列为（AG）8YT为此次试验的引物。药材浸泡液组成：10 mmol/L Tris HCl(pH 8.0)，200 mmol/L EDTA(pH 8.0)，50 mmol/L NaCl溶液，灭菌后使用；DNA提取缓冲液组成：0.1 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris HCl(pH 8.0)，100mmol/L EDTA(pH 8.0) ，灭菌后使用。地龙药材由广东，福建、湖北、上海等地药材市场收集后，经广州中医药大学李薇教授鉴定，分别为钜蚓科动物参环毛蚓Pheretima aspergillum (E Perrier)和威廉环毛蚓Pheretima guillelmi(Michaelsen)的干燥体，均属于《中国药典》2005年版Ⅰ部“地龙”项下规定的品种。

　　2 方法

　　2.1 基因组DNA的提取和检测采用异丙醇沉淀法，从地龙药材样品的表皮组织中提取总DNA。步骤：剪取药材中段，去除腹部泥沙。纯水冲洗内外，保存在药材浸泡液中4℃，24h以上，弃去浸泡液，剪碎材料，放入玻璃匀浆器中，分2次（1 000，1 000 μl）加入共2 000    μl DNA提取液于冰上匀浆至不见组织块状物，全部倒入5 ml塑料离心管中。加入10％SDS 200 μl, 20 mg/ml蛋白酶K 20 μl，充分混匀，放入55～65℃水浴锅中温浴2 h，每隔15 min取出颠倒混匀。吸取800 μl于1.5 ml EP管中，加入600 μl饱和NaC1，在旋涡混匀器上高速混合30 s，10 000 g离心30 min，移上清到另一EP管中。加入等体积异丙醇，混匀，置－20℃ 1 h，然后10 000 g离心20 min，弃上清。沉淀加入70％乙醇500 μl洗涤3次，干燥后将其溶于100 μl TE中，经1％琼脂糖凝胶电泳分析，UVP凝胶成像分析系统拍照，稀释成终浓度20～50 ng/μl ,保存-20℃备用。

　　2.2 ISSR-PCR反应初始条件及程序参照文献中文蛤［9］、河蟹［10］等ISSR分析的反应体系和扩增程序进行预实验，设计初始50 μl反应体系：1×Taq酶配套缓冲液，DNA模板50 ng，2.5U Taq DNA聚合酶，2 mmol／L MgCl2，0.8 μmol／L引物，0.2 mmol／L dNTPs。扩增程序为：94℃预变性5 min；然后是94℃变性30 s，50℃复性30 s，72℃ 延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸5 min，反应结束后，4℃保存。PCR扩增产物在1.5％(W／V)的琼脂糖凝胶中电泳分离，电压5V／cm。电泳结束后，在UVP凝胶成像系统上观察并照相记录。
2.3  反应体系的优化在50  μl反应体系中，模板DNA (20～50 ng/μl) 分别为0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 μl；引物浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 μmol/L；dNTPs的浓度分别为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L。Taq酶和Mg2+采用双因素作用考察见表1。每一个合适条件确定后，作为后续研究的一个条件。表1  Mg2+浓度和Taq酶双因素考察（略）

　　2.4 退火温度的确定采用梯度PCR模式，设定退火温度最低47.0℃ 和最高56.0℃ ，扩增仪自动生成l2个温度梯度，选择其中6个：49.8，50.9，52，53.1，54.2，56℃。

　　3 结果

　　3.1 模板DNA浓度的确定适宜的模板量是保证特异性扩增的前提。模板量过多会降低特异性扩增效率，增加非特异性产物。研究表明，DNA模板量在10～200 ng，扩增程度及扩增条带无明显差异，以其他地龙DNA为模板也得到同样的结果（见图1）。因此，将地龙扩增体系中的模板加入量定为50～100 ng，即在50 μl反应体系中，加入模板DNA 2 μl（20～50 ng/μl)。

　　3.2 引物浓度选择引物浓度关系到扩增产物的质量，浓度太低不能进行有效地扩增，浓度太高会增加引物二聚体地形成，导致条带不稳定及清晰度下降。结果表明，随着引物浓度的升高，扩增带由弱到强。引物浓度在0.2，0.4，0.6 μmol·L-1时较弱，0.8，1.0 μmol·L-1时扩增的条带数和亮度均一致，当达到1.2 μmol·L-1时非特异性扩增增强（见图1）。根据实验结果选择0.8 μmol·L-1，即在50 μl反应体系中，加入ISSR引物（20 μmol·L-1）2 μl。

　　3.3 dNTPs浓度选择底物dNTPs浓度过高，会导致聚合酶错误的掺入，浓度过低，又会影响合成效率，甚至会因dNTPs过早消耗而使产物单链化，影响扩增效果。通常在PCR反应体系中，dNTPs浓度应在0.02～0.2 mmol·L-1［11］，试验结果表明：dNTPs浓度在0.1～0.25 mmol·L-1时，均有扩增产物。浓度在0.2 mmol·L-1时，PCR反应稳定性和扩增产物效率最高，背景干扰少，条带清晰（见图1）。因此，将地龙ISSR-PCR扩增体系中的dNTPs浓度定为0.2 mmol·L-1，即在50μl反应体系中，加入dNTPs（10 mmol·L-1 each）1 μl。

　　3.4 Taq酶和Mg2+双因素作用考察Taq酶的种类以及使用量直接影响扩增反应的成功与否。使用高浓度的Taq酶不仅提高了成本，而且也容易产生非特异性扩增产物；而当Taq酶浓度过低时，则会使酶过早地消耗完，产物合成效率低。
   
　　Mg2+浓度是影响PCR结果的重要变量之一。选择合适的Mg2+浓度对PCR反应至关重要。Taq酶是Mg2+依赖酶，对Mg2+浓度非常敏感。引物与模板的双链杂交体的解链与退火温度受二价阳离子的影响，特别是其中的Mg2+浓度能影响反应的特异性和扩增片段的产率。在一般的PCR体系中，Mg2+用量比较合适的是1.5～2.0 mmol·L-1［11］，50 μl体系中Taq酶用量为1.0～5.0 U［11］。研究结果表明：在50 μl  PCR体系中，2.0 mmol·L-1的Mg2+结合2.0 U Taq酶用量反应结果最佳。见图2。

　　3.5 引物退火温度的考察PCR反应中，退火温度的高低直接影响到引物与模板DNA的特异性结合。用以上所得到的最佳因素水平组合，针对引物的Tm值进行梯度退火实验，PCR产物进行电泳检测，以扩增出条带多，背景清晰的温度作为候选的火候温度。结果见图3。表明52℃为引物834较合适退火温度。

　　通过对上述条件的优化，筛选出适宜于地龙药材ISSR－PCR的反应体系，50ul的体系组成为：1×Taq酶配套缓冲液，DNA模板约50 ng，2.5U Taq DNA聚合酶，2 mmol／L MgCl2，0.8 μmol／L引物，0.2 mmol／L dNTPs。扩增程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃复性30 s（据不同引物的退火温度），72℃ 延伸1.5 min，共35个循环；72℃延伸5 min，反应结束后，4℃保存。利用此优化系统，选择引物UBC834对地龙药材的18个样品进行了扩增，得到了背景清晰、多态性稳定丰富的DNA扩增片段（见图4），可用于地龙药材的鉴别及遗传结构分析研究。

　　4 讨论

    ISSR扩增易受多种因素的影响，如模板DNA、Taq酶、dNTPs、Mg2+ 以及引物等，扩增条件的变化会对ISSR图谱产生较大的影响，从而影响ISSR分析的准确性和稳定性，因此为了获得重复性和可靠性高的ISSR图谱，对地龙进行引物的筛选、PCR扩增条件的优化及不同引物的退火温度的确定十分必要。引物选择是ISSR技术中最关键和重要的一环。常为3’或5’端加锚（1～4个碱基）的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重复序列，重复次数常为4～8次。实际研究工作中常参考加拿大哥伦比亚大学（University of British Columbia，UBC）设计并公布的ISSR引物序列。本实验采用逐一研究各因素不同处理水平的影响，较快地建立了适合地龙的ISSR－PCR优化体系，为后续地龙药材的鉴别及遗传结构分析研究奠定了技术和理论基础。

【参考文献】
  　　［1］吴文如,李薇.地龙类药用动物的比较鉴别［J］.现代生物医学进展,2007,7(11):1754.

　　［2］国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2005：80.

　　［3］李兰燕,王树春,吴云山,等．广地龙的X射线衍射Fourier谱鉴定［J］.中成药,2002,24(5):380.

　　［4］姜文红,张清波.地龙HPLC指纹图谱分析方法的研究［J］.中医药学报，2006,34(6):13.

　　［5］Zietkiewicz E,Rafalski A,Labuda D．Genome fingerprinting by simple sequence repeats(SSR) anhorcd polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics,1994, 20:176 .

　　［6］Li H S．Chen G Z．Genetic persity of sonneratia alba in China detected by inter simple sequence repeats(ISSR) analysis［J］.Acta Bot Sin,2004,46(5):137.

　　［7］Ammiraju J S．Dholakia B B,Santra D K,et a1．Identification of inter simple sequence repeat(ISSR) markers associated with seed size in wheat［J］.Theor Appl Genet．200l,l02(6):726.

　　［8］陈祖云, 王晓丽,宋聚先.贵州天麻遗传多态性的ISSR初步分析［J］.中华中医药杂志, 2007, 22(7): 436.

　　［9］刘广绪,包振民,胡景杰,等.栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝及其种间杂交子代、种内交配子代的ISSR分析［J］.中国海洋大学学报,2006,36(1):71.

　　［10］郑芳,吕秀玲,孙红英,等.ISSR标记在河蟹种质检测中的应用［J］.中国水产科学.2007,14(1):46.

　　［11］周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用［M］.北京:化学工业出版社,2005：