卵巢上皮性肿瘤中B7-H4表达及临床意义

【摘要】 目的：探讨B7-H4在卵巢癌中的表达及其临床病理意义。方法：采用免疫组织化学染色PV6000法检测13例正常卵巢组织、20例卵巢良性上皮性肿瘤组织、20例卵巢交界性上皮性肿瘤组织、40例卵巢癌组织标本中B7-H4的表达，并对其中40例卵巢癌B7-H4的表达与年龄、组织学类型、病理分期、分级及淋巴转移和患者预后之间的关系进行统计学分析。结果：⑴B7-H4在正常卵巢组织、卵巢良性上皮性肿瘤、交界性上皮性肿瘤及卵巢癌组织中的阳性表达比例分别为7.7% (1/13)、20%(4/20)、60% (12/20)、90% (36/40)，交界性及恶性标本阳性比例明显高于非恶性标本，差异有统计学意义(P<0.05)。⑵40例卵巢癌标本中浆液性癌、内膜样癌、透明细胞癌、黏液性癌的B7-H4蛋白阳性比例分别为23/23、3/3、6/6、4/8，黏液性癌的蛋白阳性比例明显低于前三组，差异有统计学意义(P<0.05)。⑶B7-H4在卵巢癌Ⅲ期～Ⅳ期的阳性表达率显著高于卵巢癌Ⅰ期～Ⅱ期，差异有统计学意义(P<0.05)。结论：⑴40例卵巢癌组织中B7-H4的表达与组织学类型、病理分期及预后相关，而与年龄、病理分级和淋巴结转移等无关。⑵B7-H4抑制了卵巢癌组织中肿瘤浸润淋巴细胞的功能，其有可能成为辅助卵巢癌诊治的新的靶目标。

【关键词】 B7-H4；肿瘤浸润淋巴细胞；卵巢上皮性肿瘤；免疫组织化学

Expression of B7-H4 in Epithelial Tumor of Ovary

Wang Yongli,Liang Jianfang,Zheng Huixia,et al.

Department of Pathology, First Clinical Medical College,Shanxi Medical University

Abstract Objective:To evaluate the expression of B7-H4 in epithelial ovarian tumor and the relationship between B7-H4 expression and the clinicopathological variables.Methods:Archival tissue blocks from 93 epithelial ovarian tumor patients including 13 normal ovarian tissues,20 benign tumors,20 borderline tumors,23 serous carcinomas,3 endometrioid carciniomas,6 clear cell carcinomas and 8 mucinous carcinoma were evaluated by immunohistochemistry PV6000 for the expression of B7-H4,and to analyze their relationship with age,histology type,pathology stage,cell differentiation,lymphametastasis and patient prognosis.Results:⑴ The expression of B7-H4 in 13 normal ovarian tissues,20 benign tumors,20 borderline tumors and 20 ovarian cancers was 7.7%(1/13),20%(4/20),60% (12/20),90% (36/40)respectively.The expression of B7-H4 was higher in ovarian cancer than in ovarian borderline tumor and benign tumor(P<0.05).⑵The expression of B7-H4 in 23 serous carcinomas,3 endometrioid carciniomas,6 clear cell carcinomas and 8 mucinous carcinoma was 23/23,3/3,6/6,4/8 respectively(P<0.05).⑶The expression of B7-H4 decreased significantly in stage Ⅰ and of stage Ⅱ ovarian cancer,compared with that in stage Ⅲ and stage IV. Conclusion:⑴The expression of B7-H4 is correlated with the tumor histology type,pathology stage and patient prognosis,independent of age,cell differentiation,lymphametastasis.⑵These results suggest that the expression of B7-H4 on tumor tissue may contribute to negative regulatory immunue responses against TILs in ovarian cancer.It may be a new target of diagnosis and/or treatment for ovarian cancer.

Key wards B7-H4;TILs;Epithelial tumor of ovary;Immunohistochemistry

卵巢癌病死率居妇科恶性肿瘤之首［１］，因易转移而广泛播散，约2/3患者确诊时已届Ⅲ期或Ⅳ期，其5年生存率只有15%［２］。虽然目前卵巢癌术后辅助治疗取得了一定的进展，但距生存期的根本提高和对生活质量的要求仍有一定的距离，所以，确定新的分子靶位成为卵巢癌整个治疗过程中非常重要的环节。

B7-H4是新近发现的共刺激分子家族成员，体外实验证明在接受抗原信号刺激后B7-H4可阻止T细胞的活化，并抑制其增殖及减弱各种细胞因子的分泌［３］，多种肿瘤细胞株和组织中均存在B7-H4表达［４］。本研究主要对93例卵巢组织及肿瘤切除标本中B7-H4的表达情况进行检测，并分析其与患者临床病理特征间的关系，旨在寻找更为准确的能够辅助诊断和指导治疗的靶目标。

1 材料与方法

1.1 资料

收集我院2003年6月～2007年12月卵巢组织及肿瘤切除标本93例，其中，正常卵巢组织13例，良性卵巢上皮性肿瘤20例，交界性上皮性肿瘤20例，恶性40例，所有病例均经病理学证实。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂：兔抗人B7-H4单克隆抗体为北京博奥森生物科技有限公司产品，免疫组化试剂盒PV-6000购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2.2 实验方法：B7-H4的免疫组化采用Envision法。所有标本均经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片，56 ℃烤片过夜，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化、3%H2O2封闭内源性过氧化物酶后，经高压修复1 min后滴加B7-H4抗体稀释液1∶200，经DAB染色，苏木精复染，脱水透明封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，乳腺腺癌组织为阳性对照［５］。

1.2.3 结果判定：肿瘤细胞胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性，根据阳性细胞百分率和染色程度进行半定量分析。（-）：无显色反应；(+)：阳性细胞数＜25%，染色呈棕黄；（）：阳性细胞数25%～50%，染色呈棕黄或棕色；（）：阳性细胞数≥50%，染色呈棕色或深棕色［６］。

1.3 统计学分析

结果采用χ２或Fisher’s 精确检验，中位生存时间的计算采用寿命表法，单因素生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验，P<0.05有统计学意义。所有资料均采用SPSS13.0统计软件包进行分析。

2 结果

2.1 临床资料

2.1.1 一般资料：患者年龄18岁～76岁，>49岁者57例，占61.3%。正常卵巢组织13例，良性卵巢肿瘤20例，交界性20例，恶性40例。40例卵巢癌患者平均年龄(49±15)岁，按FIGO分期，Ⅰa 2例，Ⅰb 3例，Ⅰc 1例，Ⅱa 2例，Ⅱb 4例，Ⅲa 3例，Ⅲb 6例，Ⅲc 16例，Ⅳ 3例。

2.1.2 临床治疗：早期患者均行全子宫+双附件切除术，28例晚期患者中：8例行全子宫+双附件+大网膜切除术，17例加盆腔淋巴结清扫，3例只行姑息性肿块切除；晚期患者行肿瘤细胞减灭术理想者(无残灶或残灶<2 cm)12例(42.86%)，不理想者(残灶≥2 cm)9例(32.14%)，7例未化疗(25%)；21例化疗者中，5例化疗疗程<6个(23.81%)，余16例均做联合化疗(76.19%)。

2.1.3 随访结果：40例卵巢癌患者存活时间为0.73月～64.9月，3年以上仅7例，占17.5%，5年以上仅5例，占12.5%。死亡35例，存活时间0.60月～58月，平均23.74月，均为Ⅰb及以上，其中Ⅰb2例，Ⅰc 1例，Ⅱa 1例，Ⅱb 3例，Ⅲa 3例，Ⅲb 6例，Ⅲc 16例，Ⅳ 3例。

2.1.4 生存状况比较：生存率：40例卵巢癌患者随访率100%，死亡35例，均死于该疾病。全组患者中位生存时间33.8月，5年生存率为7.5%(见图1)；B7-H4的表达与生存率的关系见图1。单因素分析结果显示，B7-H4的表达阳性程度不同，其生存率不同，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 病理资料

93例均经病理证实，13例正常卵巢组织取自因子宫及宫颈的恶性病变而切除的双侧附件组织，20例良性卵巢上皮性肿瘤组织，20例交界性卵巢上皮性肿瘤组织及40例卵巢癌，其中卵巢癌直径0.7 cm～36 cm，平均2.7 cm，镜下浆液性23例(57.5%)、内膜样癌3例(7.5%)、透明细胞癌6例(15%)、黏液性癌8例(20%)，17例行盆腔淋巴结清扫术，淋巴转移13例，占76.5%。 2.3 不同病变卵巢组织中B7-H4的表达

B7-H4在卵巢恶性肿瘤组织中的表达见图2。在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、交界性及恶性肿瘤的阳性表达率分别为7.7%、20%、60%、90%。B7-H4在正常卵巢组织、良性肿瘤中的表达无统计学差异(P>0.05)，在交界性、恶性肿瘤组织中的表达明显高于其它两组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。 表1 不同组别组织中B7-H4蛋白阳性表达率

*与前两组比较，差异有统计学意义P<0.05

2.4. 卵巢癌组织中B7-H4的表达及与临床病理参数间的关系

40例卵巢癌标本中浆液性癌、内膜样癌、透明细胞癌、黏液性癌的B7-H4蛋白阳性表达率分别为100%、100%、100%、50%，前三组组织中B7-H4的表达均显著高于黏液性癌，而与年龄、细胞分化和淋巴结转移等无关，见表2。表2 卵巢上皮性癌中B7-H4的表达与临床病理参数间的关系

3 讨论

卵巢肿瘤是女性生殖器常见的三大恶性肿瘤之一。其中，卵巢恶性肿瘤仍然是妇科恶性肿瘤患者死亡的首要原因［１］，虽然近年来卵巢癌的化学和内分泌治疗进展较快，在一定程度上提高了疗效，但因70%～80%的卵巢癌发现时已属晚期，治疗极其困难，即使暂时缓解亦常在2年～3年后复发，患者的生存期仍不理想。B7-H4是新近发现的B7共刺激分子家族中的成员，属于免疫球蛋白超家族。其转录形式可表达于肺、睾丸、胰腺、肾和肝等组织中，蛋白水平上表达很少，但在部分肿瘤细胞株和组织中却常呈组成性表达［７］，因此推测其具有下调机体抗肿瘤免疫应答的作用。

本研究检测了13例正常卵巢组织及80例卵巢肿瘤组织中B7-H4的表达，结果显示，B7-H4以胞浆表达为主，正常卵巢组织及良性、交界性、恶性肿瘤组织中其阳性率分别为7.7%、20%、60%、90%，与Iris Simon等的研究结果相似［８］，同时发现B7-H4的表达与组织学类型相关：浆液性、内膜样及透明细胞癌中其阳性率均为100%，黏液性卵巢癌的B7-H4表达水平显著降低，仅50%，差异有统计学意义(P<0.05)，提示B7-H4在非粘液类卵巢癌的诊断方面有重要价值。此外，Ⅲ期～Ⅳ期与Ⅰ期～Ⅱ期卵巢癌相比B7-H4阳性表达率显著升高达100%(P<0.05)，但B7-H4的表达与卵巢癌的组织学分级、有无淋巴结转移及年龄等均无相关性。

已知在特异性的T细胞激活过程中，T细胞的活化需要T细胞受体(T cells receptor，TCR)和非特异性的共刺激信号辅助，因此，共刺激分子对免疫反应的启动非常重要。B7-H4是B7共刺激分子家族中的重要成员之一，体外研究发现接受抗原刺激信号后B7-H4可阻止T细胞的活化、抑制T细胞的增殖，减弱IL-2、IL-4、IL-10及IFN-γ等细胞因子的分泌［３］，从而负性调节外周组织的细胞免疫应答［９，１０］。现有的研究已表明免疫在恶性肿瘤的发生、发展、转移及预后中起着不容忽视的作用，免疫反应体系中某一环节的缺陷常是导致肿瘤发生的重要原因之一。虽然目前对B7-H4负性调节细胞免疫应答的机制研究甚少，但能够推测，肿瘤组织中过度表达的B7-H4蛋白抑制了机体对肿瘤细胞的正常免疫应答，使得肿瘤的发生、发展、甚至转移均成为可能。本研究中B7-H4在卵巢癌组织的胞浆部位高度表达，浆液性、内膜样及透明细胞癌中其阳性率均高达100%，提示可将其作为分子水平治疗卵巢癌的可能的靶目标［９］。已有研究数据显示，B7-H4不仅在卵巢肿瘤细胞中表达，在肿瘤相关巨噬细胞中也有表达，已知机体部分T细胞对卵巢肿瘤抗原进行特异性的免疫应答作用，B7-H4+肿瘤相关巨噬细胞与CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞(Treg cells) 则均对这部分T细胞有抑制作用［１１］。T细胞的免疫活性是乳腺癌等恶性肿瘤有确切意义的预后指标［１２］，机体免疫应答受到抑制就会促进肿瘤的恶性进程，从而导致患者的不良预后，B7-H4的过度表达抑制了肿瘤相关淋巴细胞(tumor-associated lymphocytes，TALs)的数目和功能，这可能是使卵巢癌逃逸免疫监视的机制之一。在本研究中，通过对40例卵巢癌患者的生存分析得出B7-H4 影响患者的预后，B7-H4为负性预后因子，阳性表达提示预后不良。可见，卵巢癌中B7-H4的高表达，降低了机体对肿瘤细胞的特异免疫力，促使癌细胞转移，形成肉眼不能辨别的新癌灶，从而影响患者的预后，使患者的中位生存期逐渐缩短，这也成为抗B7-H4生成能有效控制肿瘤生长,提高预后的理论依据。

综上所述，B7-H4在卵巢癌组织中高度表达，与肿瘤的组织学类型密切相关，并在对肿瘤相关淋巴细胞数目的抑制和促进肿瘤转移浸润的过程中起关键作用，提示可将其作为临床新抗体疗法的潜在靶目标。

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