空心莲子草正丁醇部位高效液相色谱指纹图谱研究

【摘要】 目的建立空心莲子草正丁醇部位的高效液相色谱（HPLC-ELSD）指纹图谱。方法HPLC-ELSD法测定，流动相为乙腈-水梯度洗脱，流速为1.0 ml·min-1，蒸发光散射（ELSD）检测器，柱温35℃。结果运用梯度洗脱能较好的分离空心莲子草正丁醇部位化合物；经方法学考察，HPLC-ELSD指纹图谱具有良好的重复性，初步建立了以12个共有峰为特征指纹信息的HPLC-ELSD指纹图谱。 结论建立的空心莲子草正丁醇部位的HPLC-ELSD指纹图谱分析法可为空心莲子草的质量评价提供参考。

【关键词】 空心莲子草； 指纹图谱； 高效液相色谱； 蒸发光散射检测器

Abstract:ObjectiveTo establish the HPLC-ELSD of n-butylol froution of Altemanthera philoxeroide.MethodsThe gradient elution was adopted with a mixture consisting of acetonitrile and water, the flow rate was 1.0 ml·min-1，and the detector was ELSD. ResultsThe constituents of Altemanthera philoxeroide were well separated on HPLC and the HPLC-FPC of 10 batches of samples was established.The results showed that this method had a good repeatability and the 12 common peaks had an exclusive properties.ConclusionThe method developed can supply the reference for the quality evaluation of Altemanthera philoxeroide.

Key words:Altemanthera philoxeroide； Fingerprint chromatography； HPLC； ELSD

空心莲子草Altemanthera philoxeroides (Mart.)Griseb为苋科(Amaranthaeeae) 莲子草属Ahemanthera多年生宿根草本植物,又名空心苋、螃蜞菊、水花生、喜旱莲子草。据《中药大辞典》记载：本品之根味苦，性寒；茎叶味微甘，性寒，具有清热、凉血、解毒、利尿的功效，适用于淋症、麻疹、疔疮及热毒诸症。临床研究发现空心莲子草具有抗病毒、抗菌、护肝等作用，被用于治疗流感、麻疹、单纯性疱疹、流行性出血热、黄疸肝炎、乙型肝炎等疾病［1］。空心莲子草含有多种化学成分，其中黄酮、三萜和皂苷类是其主要成分［2］。空心莲子草主要分布在长江流域，笔者从湖北、湖南、浙江、福建、江西、江苏6个省10个城市不同地方采集了空心莲子草，采用HPLC-ELSD法建立了空心莲子草正丁醇部位的指纹图谱，为空心莲子草的质量评价提供了一定依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂 Agilent1100高效液相色谱仪系列，ELSD检测器（SEDEX 75），G1311A四元梯度泵，G1322A在线真空脱气装置，G1314A柱温箱；Mettler Toledo AT20型分析天平（万分之一）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-S型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）；D101型大孔吸附树脂（天津市海光化工有限公司）；微孔滤膜（0.2 μm）。试剂：乙腈（色谱纯）；醋酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、甲醇（均为分析纯）；实验用水为二次重蒸水。

1.2 药材来源 空心莲子草药材1～10号样品均为2005-07～08分别采自湖北、湖南、浙江、江苏、江西、福建6省（均为水中生长）。见表1。

表1 样品的来源产地

样品号产地1江西九江浔阳区白水湖2福建福州马尾开发区3江西鹰潭长途汽车站附近山下4福建厦门集美5江苏南京浦口区双拢一组6江苏徐州7江苏无锡惠山区堰桥镇丁塔村8湖南怀化9湖北黄石10浙江湖州道场乡道场村

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为 Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流动相为乙腈（A）-水（B），0～40 min乙腈由5%升到23%，40～60 min乙腈由23%升到40%，60～90 min乙腈由40%变化到23%；流速为1.0 ml·min-1；柱温为35℃；ELSD检测器，压力(3.5 bar),漂移管温度为（40℃），喷口温度为40℃；进样量为10 μl。

2.2 供试品的制备 精密称取样品粗粉粉末5.0 g，加入50%乙醇50 ml，超声处理30 min，静置后补足减失乙醇溶液的重量，滤过取续滤液40 ml；水浴挥去乙醇，用40ml蒸馏水溶解，先以醋酸乙酯萃取4次（50 ml/40 ml/40 ml/40 ml），弃去醋酸乙酯液；水液再用正丁醇萃取4次（50 ml/40 ml/40 ml/40 ml），弃去水液；水浴挥干正丁醇，残渣用20 ml蒸馏水溶解，上样于D101大孔树脂柱（8 g），用35 ml蒸馏水洗脱，弃去水液，再用50%乙醇40 ml洗脱，收集乙醇液，水浴挥干乙醇，残渣用甲醇溶解，定容至5 ml；经0.2 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 稳定性实验 取同一批次供试品溶液（样品5），分别在0，3，6，9，12，24 h测定指纹图谱，结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上的峰的相对峰面积均无明显变化，其RSD分别为0.160%～1.288%和0.391%～2.892%，符合指纹图谱技术要求（RSD均在3%以内），说明供试品溶液在24 h内测定稳定性良好。2.3.2 精密度实验 取同一批次供试品溶液（样品5），连续进样5次，测定指纹图谱，考查进样精密度，结果表明各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上的峰的相对峰面积均无明显变化，其RSD分别为0.304%～1.682%和0.483%～2.885%，符合指纹图谱技术要求（RSD均在3%以内），说明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性实验 取样品5，按供试品制备方法分别制备5份供试品，测定指纹图谱。结果表明，各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5%以上的峰的相对峰面积均无明显变化，其RSD分别为0.160%～1.288%和0.391%～2.892%，符合指纹图谱技术要求（RSD均在3%以内），表明方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立 将供试品溶液按选定的测试条件，分别进样检测。测定所有供试品HPLC-ELSD色谱图。根据10批次供试品测定结果所给出的峰数、峰值（积分值）和相对保留时间等相关参数，进行分析，比较、制定优化的指纹图谱。见图1。

2.5 指纹图谱分析与评价

2.5.1 共有指纹峰标定 根据10批空心莲子草供试品的检测结果，比较其色谱图。以相对保留时间标定其共有指纹峰12个，以11号峰为参照峰（S），计算各共有峰相对保留时间，结果RSD均小于3%。见表2。表2 共有峰的相对保留时间

2.5.2 共有指纹峰面积的比值 根据10批空心莲子草供试品的色谱图结果，以参照峰的峰面积为基准，计算各共有指纹峰峰面积与参照峰峰面积的比值及平均比值。结果见表3。 表3 共有峰的相对峰面积与参照峰面积比值

2.5.3 非共有峰峰面积的比值 计算非共有峰占总面积的比值，结果表明，其比值小于10%，符合指纹图谱的要求。

2.5.4 相似度评价 将测试数据导入国家药典委员会“中药指纹图谱相似度评价系统（2004A）”软件，经校正，将谱峰自动匹配，然后生成对照指纹图谱，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出空心莲子草HPLC-ELSD指纹峰共有模式R（图1，2）；与共有模式比较，10批不同产地空心莲子草的相似度分别为0.943，0.949，0.939，0.853，0.988，0.973，0.934，0.729，0.780，0.934。见图2。

图1 空心莲子草的指纹图谱

图2 10批样品的指纹图谱

3 讨论

本项研究参照《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，采用高效液相色谱法制定了空心莲子草正丁醇部位的指纹图谱，取得了较满意的研究结果。共标定了12个共有指纹峰，方法可靠，重现性、稳定性良好。这为空心莲子草正丁醇部位的开发利用奠定了一定的基础。

3.1 供试品溶液制备方法的考察

3.1.1 不同提取方法的考察 取同样量的空心莲子草药材粉末，依次用超声波提取法和煎煮法提取并制成供试品溶液，进行HPLC-ELSD分析，结果表明，以出峰数目为考察指标，两种方法差异不大，由于超声波法简便、省时，故本实验选用超声波法制备供试品溶液。

3.1.2 不同提取醇浓度考察 取同样量的空心莲子草药材粉末，考察了50%，60%，70%乙醇提纯对峰面积的影响，结果表明浓度差异对结果影响不大，故选择50%乙醇为提取醇浓度。

3.1.3 干扰峰处理方法考察 考察了用聚酰胺树脂纯化，大孔吸附树脂纯化处理方法，发现大孔吸附树脂纯化效果较好，且便于再生处理，综合考虑，选择用大孔吸附树脂纯化为处理干扰峰的最佳方法。

3.2 UV和ELSD两种检测方法的比较由于正丁醇部位化合物的UV吸收波长为末端吸收，采用梯度洗脱时溶剂吸收使基线漂移严重，影响色谱图参数的计算；而采用ELSD检测，则梯度洗脱过程中基线平稳［3］。所以本实验采用HPLC-ELSD对样品进行检测。

3.3 相似度分析结果表明，九江、福州、鹰潭、南京、徐州、无锡和湖州产地的空心莲子草相似度较好，厦门、怀化、黄石的空心莲子草HPLC-ELSD指纹图谱与其他产区有一些差异。差异主要集中在2，3，4，5，6，7号峰的峰形及其相对高度上。产生这些差异的原因是由于空心莲子草正丁醇部位的化合物种类较多，各成分含量差异大，有些成分含量偏小。通过对10批空心莲子草正丁醇部位指纹图谱中各共有指纹峰相对峰面积数值的计算和比较，可对不同产地空心莲子草正丁醇部位化合物的相对含量进行判断。

近年来国内外报道了空心莲子草正丁醇部位的一些成分如3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛基齐墩果酸苷、齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、4，5-dihydroblumenol等［4］。在目前空心莲子草正丁醇部位中的指标性化学成分不是十分清楚的情况下，制定指纹图谱时，没有适宜的对照品或内标物作为参照物，故初步以供试品中峰面积相对较大、较稳定的共有峰作参照峰，来标定其它各共有指纹峰的相对保留时间及计算其它各共有指纹峰面积比值。

本实验对空心莲子草HPLC-ELSD指纹图谱的构建进行了初步探讨，可为空心莲子草的品质评价、质控标准制定提供参考。

【参考文献】
［1］ 江苏新医学院．中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社，1986：1471.

［2］ 熊卫国，刘雅士，刘焱文，等．空心莲子草的化学成分研究［J］.中草药，2000，31(7)：501.

［3］ 魏 泱，丁明玉．蒸发光散射检测技术［J］.色谱，2000，18(5)：399.

［4］ 方进波，刘焱文，张彦文，等. 空心莲子草抗病毒活性成分研究［J］.中草药，2007，38（7）：976.