高效液相色谱法测定五虎散中 羟基红花黄色素A的含量

【摘要】  目的建立复方制剂五虎散中红花有效成分的高效液相色谱测定方法。方法采用Agilent C18(5 μm，250 mm×4.60 mm)色谱柱；以甲醇-0.4%磷酸水（33∶67）为流动相，流速为1 ml·min-1，检测波长为402 nm。结果羟基红花黄色素的线性范围分别为0.056 5～0.452 μg(r=0.999 4),平均加样回收率(n=6)为99.15%， RSD为4.51%。结论该测定方法简便可行、重复性好，可用于该制剂中红花有效成分的含量测定。

【关键词】  五虎散； 羟基红花黄色素； 高效液相色谱

    Abstract：ObjectiveTo establish the method for determination of effective components in Wuhu powder by RP-HPLC. MethodsThe contents of hydroxysafflor yellow A was determined by an HPLC system using following conditions: the column was Agilent C18(5 μm, 250 mm×4.60 mm), with CH3OH-0.4% H3PO4water solution（33:67）as mokile phase, the flow  rate was 1.0 ml·min-1, the detection wavelength was at 402 nm. ResultsThe linear range of hydroxysafflor yellow A was 0.056 5～0.452 μg（r= 0.999 4）; its average recovery were 99.15%, corresponding RSD were 4.51%. Conclusion The HPLC method is simple, accurate, highly selective and reproducible, thus it can be used as quality control of Compound Wuhu powder.

    Key words:Wuhu powder;   Hydroxysafflor yellow A;   HPLC

    五虎散是《中国药典》收载的品种，由当归、红花、防风、天南星（制）和白芷等5味中药组成，具有活血散淤、消肿止痛作用，用于跌打损伤、淤血肿痛等。法定标准［1］中仅收载了显微鉴定和当归、白芷的TLC定性鉴别。未有含量测定标准。该制剂的疗效确切，在医院广泛使用。为建立五虎散的含量测定方法,笔者采用了HPLC法测定五虎散中羟基红花黄色素A，并对其含量测定方法进行了系统研究，现报道如下。

    1  器材

    1.1  仪器BS124S型电子分析天平（德国Sartorius）；Agilent1100型高效液相色谱仪。

    1.2  试剂甲醇（色谱纯，Merck公司），超纯水，甲醇（分析纯）。

    1.3  样品五虎散（医院制剂室生产，批号为20060801  20060803  共两批）。

    1.4  对照品羟基红花黄色素A　(批号∶111637-200502)，对照品购自中国药品生物制品检定所。

    2  方法与结果

    2.1   Agilent C18柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸水溶液（33∶67）；流速为1 ml·min-1，检测波长为402 nm；柱温：室温；进样量10 μl。在该色谱条件下，羟基红花黄色素A能够达到基线分离，其他成分对测定无干扰。结果见图1。

    2.2  样品的制备

    2.2.1  供试品溶液的制备  精密称取五虎散粉约1 g，置于10 ml具塞三角瓶中，准确加入pH为2的95%乙醇5 ml，称重，超声30 min，室温放置20 min后，以pH为2的95%乙醇补足损失的重量，摇匀，过滤。取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。 a-对照品羟基红花黄色素A  b-五虎散样品  c-缺红花阴性样品

    图1  羟基红花黄色素A的HPLC图谱

    2.2.2  对照品溶液的制备  精密称取对照品羟基红花黄色素A适量，配制成每毫升中含羟基红花黄色素A 0.565 mg的对照品溶液。

    2.3  线性关系  分别吸取对照品溶液1，2，4，6，8 μl注入高效液相色谱仪，按色谱条件测定。以各对照品进样量(Y)对峰面积(X)进行线性回归处理，结果显示，羟基红花黄色素A进样量在0.056 5～0.452 μg范围呈线性关系，回归方程为Y=1 870X+12.57，相关系数r=0.999 4。

    2.4  精密度实验  精密吸取上述对照品溶液5μl，连续进样6次，测得羟基红花黄色素A峰面积平均值为536.95，RSD为3.52%。表明分析方法精密度良好。

    2.5  稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液10μl分别在0，1，3，4，5，6 h按上述色谱条件测定6次，结果羟基红花黄色素A的平均峰面积为0.280 4,RSD为3.60%。表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

    2.6  重复性实验  取同一批号样品（20030801），按供试品溶液制备项下操作，平行制备6份，按色谱条件测定百分含量(%)，羟基红花黄色素A的平均含量为0.164 1 mg·g-1，RSD为5.0%。表明分析的重复性良好。

    2.7  加样回收率实验  精密称取已知含量的五虎散粉（20030801）0.5 g，分别精密加入一定量的羟基红花黄色素A对照品，按供试品溶液制备项下操作，重复操作6份，按色谱条件测定含量，计算回收率。结果见表1。表1  羟基红花黄色素A回收率实验结果

    3  样品测定

    精密称取活血通络片粉约1 g(同一批号称取3个样品，然后算出平均值作为结果)，按样品制备方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液4 μl与样品供试液各10 μl，按上述拟定的色谱条件测定，结果见表2。表2  样品测定结果mg·g-1

    4  讨论

    本实验曾采用乙腈-水系统、甲醇-水系统的不同梯度为流动相，结果以文中条件分离效果好，重现性强，被检成分均达到基线分离，理论塔板数均在10 000以上。

    该分析方法是在《中国药典》收载的红花含量测定方法［1］上加以改进的方法。 但我们注意到在该分析过程中，应注意控制柱温在25℃。柱温过高将影响羟基红花黄色素A分离度与峰的对称性。

    羟基红花黄色素A受热不稳定，故该提取方法宜采用短时间超声提取。实验发现超声时间过长，羟基红花黄色素A的含量下降显著。同时由于各批次原药材的有效成分含量不同，引起成品含量的波动，我们应在生产前，严格控制原药材的质量与含量。

【参考文献】
  ［1］ 国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京：化学工业出版社,2000：119,388.