海枫藤提取物对Na+，K+-ATP酶活力的影响

【摘要】 　　目的通过该研究确证彝族传统草药——海枫藤中是否含具有强心作用的活性成分，并初步了解该活性成分的存在部位及药效。方法运用大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活力测定方法检测海枫藤提取物中是否具有强心类物质。结果海枫藤茎、叶中均含有抑制Na+，K+-ATP酶活力的物质；茎提取物的抑制效果明显优于其它，且其强心活性与剂量呈正相关；同强心苷类物质地高辛比较，海枫藤茎水提取物与地高辛对心肌Na+，K+-ATP酶活力的抑制作用无显著性差异。结论 海枫藤提取物中具有类似于强心苷的活性成分存在，该活性物质主要存在于茎中，且茎的水提取物中含有的强心成分与地高辛的强心作用相近。

【关键词】 海枫藤 Na+ K+-ATP酶 强心

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of the extracts from Marsdenia officinalis Tsiang et P.T.Li on Na+,K+-ATPase activity and to affirm some cardiotonic materials in the plant.MethodsThe extracts were separated from stems, fruits and leaves of Marsdenia officinalis Na+,K+-ATPase activity of SD rat heart sarcolemma was determined.ResultsThe extracts from stems and leaves of Marsdenia officinalis could inhibit the activity of Na+,K+-ATPase,and the extract from the stems had a stronger inhibition to the activity of the Na+,K+-ATPase than the others, and showed a dose-dependent manner. At the same time, the hydro-extraction from stems had no significant difference with Desacetyllanatoside in inhibiting activity of the Na+,K+-ATPase. ConclusionThere are active ingredients in the extract of Marsdenia officinali which is similar to cardiac glycoside. These ingredients exists mainly in stems. The cardiotonic function of hydroextraction from stems is the same as Desacetyllanatoside.

　　Key words:Marsdenia officinalis Tsiang et P.T.Li; Na+，K+-ATPase; Cardiac stimulation

　　萝藦科植物富含强心苷类成分［1］，如杠柳属的美叶杠柳Periploca calophylla (Wight.) Falconer［2］，杠柳Periploca sepium Bge.［3］、马利筋属的马利筋Asclepias curassavica L.［4］，以及马达加斯加胶藤Cryptostegia madagascarien sis Bojer. 等［5］。心肌细胞膜上的Na+，K+-ATP酶的活性与心肌收缩速率有直接联系，研究表明，强心苷类物质可通过抑制心肌Na+，K+-ATP酶活力来提高心脏搏动速率［6，7］。

　　海枫藤Marsdenia officinalis Tsiang et P.T.Li为萝藦科牛奶菜属藤木类植物，具舒经通络、除湿止痛等功效，在云南省彝族地区特别是哈尼族地区常用于治疗风湿、关节炎等病症，为当地少数民族常用草药。目前海枫藤在临床上仅以配方中药中的一味少量运用于关节炎的治疗，其提取物活性成分、生理活性和药理等方面均未见报道。为确定海枫藤的具体生理功效，挖掘和开发新的民族药物，就海枫藤提取物对SD大鼠心肌Na+，K+-ATP酶活力的影响，开展了以下研究工作。

　　1 器材

　　1.1 材料

　　海枫藤Marsdenia officinalis Tsiang et P.T.Li，由本系翟书华老师于昆明市石林县圭山野外采集而得，并分类鉴定；地高辛，杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药公司；实验动物选用健康成年Sprague-Dawley（SD）鼠，雌雄不拘，体重200～220g，由昆明医学院动物实验中心提供。

　　1.2 仪器

　　UV-1600双光束紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；旋转蒸发仪（东京理化）；水浴锅；循环水式多用真空泵；低温离心机（eppendorf）；捣碎机；超低温冰箱（美国热电）；冻干机（德国Christ Alpha 1-2）；干燥箱。

　　1.3 试剂组织匀浆液（蔗糖0.25mol/L，EDTA 25 mmol/L，Tris 10 mmol/L，pH 7.0），反应液Ⅰ（ATP 5.0 mmol/L，MgCl2 5.0 mmol/L，NaCl 120 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，Tris 25 mmol/L，NaN3 5.0 mmol/L，pH 7.4），反应液Ⅱ（即在反应液I中加100 mg/L的地高辛），反应液Ⅲ（反应液Ⅰ中加入不同浓度的样品溶液）；铁剂（含10%三氯醋酸，1%硫脲，3%硫酸亚铁），定磷试剂（为11 g鉬酸铵与22.5 ml浓硫酸先溶于100 ml水中，再稀释至250 ml），其余未注明试剂均为国产分析纯。

　　2 方法

　　2.1 海枫藤果实、茎和叶中有机成分的提取分离流程

　　根据海枫藤果实、叶、茎有机成分提取分离流程，分离获得样品g1，g2，j1，j2，y1，y2。

　　2.2 心肌组织匀浆的制备［7］取健康SD大鼠8只，击头致昏，速取心脏，放入预冷的0.9%NaCl中洗去血液，滤纸吸干，称量后按25∶1（V/W）加入组织匀浆液，在冰浴中用玻璃匀浆器制成心肌组织匀浆，经三层纱布过滤，滤液于0～4℃冰箱保存。

　　2.3 酶促反应［7］每管加0.1 ml心肌组织匀浆，空白管加0.4 ml10%三氯醋酸和0.5 ml反应液Ⅰ；总酶管加0.5ml反应液Ⅰ；Mg2＋-ATP酶管加0.5 ml反应液Ⅱ；给药管加0.5 ml反应液Ⅲ。置37℃恒温水浴中振荡20 min取出，立即放入冰浴。除空白管外，其余管迅速加入0.4 ml 10%三氯醋酸终止反应，振荡后3 000 r/min离心10 min，取上清液用Harry法测定无机磷含量。与此同时吸取0.1 ml组织匀浆作适当稀释后用Bradford法测定蛋白质含量。标准蛋白质溶液采用牛血清蛋白配制，准确称取12.5 mg，加蒸馏水至50 ml，酶活力单位以每小时每毫克蛋白水解ATP产生的无机磷的微摩尔数表示［即μmol·pi/(mg·pr·h)］。

　　2.4 统计学分析两组间数据差异比较采用Student－t检验，多组间数据差异采用Duncans新复极差法检验，当P<0.05时认为差异显著，P<0.01时认为差异极显著。

　　3 结果

　　3.1 海枫藤提取物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的影响用上述方法测得大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力为0.712 μmol·pi/ (mg·pr·h)，占总酶活力的15.1%，海枫藤提取物对Na+,K+-ATP酶活力的影响见表1。表1 海枫藤提取物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的影响（略）

　　由以上结果可以看出，海枫藤茎、叶提取物中含有明显抑制Na+,K+-ATP酶活力的物质，即含有强心类物质。与叶提取物结果对比可知，海枫藤的强心物质主要存在于茎中。3.2 不同浓度的海枫藤茎提取物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的影响用10，5，2.5，1 mg/ml不同浓度海枫藤茎醇提物和水提物测定大鼠心肌Na+,K+-ATP酶的活力，结果见表2。表2 不同浓度海枫藤茎提取物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的影响(略)

　　由以上结果可以看出，海枫藤茎提取物中含有能明显抑制Na+,K+-ATP酶活力的物质，抑制率与剂量呈正相关。海枫藤茎醇提物的抑制回归方程为Y＝0.719－0.050 7X,r =0.999 4，其半数抑制浓度IC50为7.16 mg/ml。海枫藤茎水提物的抑制回归方程为Y=0.731 1 -0.056X，r=0.987 9，其半数抑制浓度IC50为6.72 mg/ml。

　　3.3 海枫藤茎提取物与强心类药物抑制大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的比较用5 mg/ml海枫藤茎提取物和强心类药物测定大鼠心肌Na+,K+-ATP酶活力，比较海枫藤提取物的强心功效，结果见图1。

　　结果表明，地高辛和海枫藤提取物均具有明显抑制大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的作用。在同样浓度（5 mg/ml）条件下海枫藤茎醇提物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的抑制效果明显低于地高辛（海枫藤茎醇提物抑制率为35.0%，地高辛为47.7%），而海枫藤茎水提物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的抑制效果（41.4%）与地高辛的抑制效果没有显著性差异。

　　4 讨论

　　本研究通过海枫藤果实、茎和叶的乙醇及水提取物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活性影响的检测实验，发现海枫藤茎、叶的提取物能显著抑制大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶的活性（P<0.05），表明该植物中含有类似于强心苷的活性成分存在。海枫藤叶的水提取物和茎的乙醇提取物、水提取物均能明显抑制Na+,K+-ATP酶的活性，但相比较而言，茎提取物的抑制效果较叶提取物抑制效果明显。茎提取物对Na+,K+-ATP酶活性的抑制率与其剂量呈正相关关系，茎醇提物的半数抑制浓度IC50为7.16 mg/ml，海枫藤茎水提物的半数抑制浓度IC50为6.72 mg/ml。由此可知，海枫藤含有具强心作用的化合物，即含有强心类物质，且该强心类物质主要存在于茎中。

　　Na+,K+-ATP酶作为一种生命活动的供能物质，广泛存在于细胞膜上，通过水解ATP维持细胞的多种生理功能，与神经、肌肉兴奋性和传导性功能有密切关系。研究表明，心力衰竭时，细胞外Ca2+不易进入心肌细胞，肌浆网贮存和释放Ca2+的能力减低，影响肌凝蛋白原-Ca2+复合体的生成，使兴奋收缩偶联失常。强心苷类物质与心肌细胞膜上的Na+,K+-ATP酶的α单位结合，抑制肌膜Na+-K+-ATP酶，增加Na+内流，K+外流，细胞内Na+堆积，促使Na+-Ca2+交换，Ca2+内流增加，改变细胞内游离钙离子量而增加心肌收缩力，使衰竭心脏的心排血量和心脏作用增加，左心室舒张末压和舒张末容量增加，对心功能降低者的作用较正常心脏显著。心率失调，与心肌细胞内钙平衡失调，细胞内肌浆网钠－钙交换以及钙释放减少等机制有关［6］，因此，通过海枫藤提取物对大鼠心肌细胞膜Na+,K+-ATP酶活力的影响进行研究，可检测其提取物中是否含有类似强心苷且具强心作用的活性成分。由于强心苷类物质可溶于水亦可溶于乙醇，因此海枫藤茎的醇提物和水提物均能明显抑制Na+,K+-ATP酶的活性。同时与强心苷类强心化合物——地高辛对比可知，海枫藤茎的水提取物中含有的强心成分与地高辛的强心作用相近（与地高辛的抑制效果没有显著性差异），但海枫藤茎水提物中的强心活性成分是否是强心苷类物质还需要进一步研究才能确证。

　　彝族药物是彝族人民长期同疾病作斗争的经验总结和智慧结晶，是中国医学伟大宝库中的一个重要组成部分。彝族地区产名贵药已有悠久历史，彝族药物数达千种，包括有动物药、矿物药、植物药，其中以植物药和动物药运用较为广泛。彝医植物药多以鲜品入药，并且使用单味药较多。云南白药、排毒养颜胶囊等利用彝族药物资源开发的药品在医药行业中独树一帜，成为民族药物开发利用的典范。因此通过对彝族传统药用植物的系统研究、整理、挖掘和开发民族药，可进一步开发新的高效的中药产品，将这些独特的少数民族千百年智慧的结晶以科学的方式服务于大众，为天然植物资源开发和利用取得新的突破和成果。海枫藤 Marsdenia officinalis Tsiang et P.T.Li为萝藦科牛奶菜属藤木类植物，具舒经通络、除湿止痛等功效，在彝药中常用于治疗风湿、关节炎等病症，特别在云南省哈尼族（彝族的一个分支）聚集地区，海枫藤为当地少数民族的常用中草药。目前对海枫藤的了解和研究仅保持在复方中药治疗风湿和关节炎的层次上，对其成分、药理、药效等均未见报道，因此从新药开发和民族药开发利用的角度上来讲，对海枫藤的研究具有重要意义。

【参考文献】
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