石榴的质量标准研究

【摘要】  　　目的建立石榴的质量控制标准。方法采用薄层色谱法对石榴有效成分没食子酸进行定性分析；采用高效液相色谱法测定石榴中没食子酸含量。结果石榴供试品与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；没食子酸的浓度在4.62～23.10 μg·ml-1范围内呈良好的线性关系（r=0.999 8），平均回收率98.19 %（RSD=1.68%）。结论该方法灵敏，准确可靠,重复性好，可作为石榴质量控制的方法。

【关键词】  石榴；没食子酸；薄层色谱法；高效液相色谱

　　Abstract：ObjectiveTo establish the qualitative control methods for Pomegranate.MethodsThe thin layer chromatographic method was used for identification of gallic acid in pomegranate , and the high performance liquid chromatographic method was used for assay. Results Pomegranate for sample and reference substance showed the same color  dot in corresponding chromatograph position .The standard curve showed a good linear relationship within the range of 4.62～23.10μg·ml-1. The average recovery was 98.19% with the RSD of 1.68%. ConclusionThe methods are sensitive and reliable , and can be used to control the quality of the pomegranate

　　Key words：Pomegranate;  Gallic acid;   TLC;   HPLC
   
　　石榴为石榴科植物石榴Punica granatum L.的干燥成熟果实。蒙药名为：阿纳尔、色布茹［1～3］，具有温中，消食，开胃，祛“巴达干”，止泻的功能。用于胃火衰退，“巴达干”病，恶心，消化不良，肺、肝、肾“赫依”，寒泻，腹胀嗳气等［1，2］。石榴中含有鞣质类、黄酮类等成分，鞣质是石榴中最普遍的一类化学成分［4，5］。为控制其质量，本文用薄层色谱法对没食子酸进行定性鉴别，采用反相高效液相色谱法测定了5批不同产地石榴中没食子酸含量，以期为石榴质量控制提供可靠的依据。

　　1 仪器与试药

    依利特高效液相色谱仪（大连依利特科技有限公司），P230高压恒流泵，UV230+紫外-可见紫外检测器，EC2000色谱数据处理系统。十万分之一、万分之一电子天平（梅特勒-托利多公司）。没食子酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号110831-200302）；石榴药材（四川、云南两个产地,5个批次）；甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其他试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1  定性鉴别取本品粉末（过2号筛）2 g，置具塞锥形瓶中，加入水50 ml，静置约12 h，加热回流3 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇使溶解，并定容至5 ml，取上清液，作为供试品溶液。另取没食子酸对照品，加甲醇制成每毫升含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［6］实验，吸取上述供试品溶液8～10 μl，对照品溶液2 μl，分别点于同一硅胶GF254板上，以环己烷-醋酸乙酯-甲酸-水（5：7：2：3）上清液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1。

　　2.2 含量测定

　　2.2.1  色谱条件与系统适用性实验色谱柱为 Sinochrom ODS-bp C18柱 （4.6 mm ID ×250 mm ，5 μm）；ODS 预柱；流动相为甲醇-0.5%磷酸（5∶95）；流速为1 ml·min-1；检测波长为273 nm；柱温为室温；没食子酸峰与相邻色谱峰的分离度大于1.5；理论塔板数按没食子酸峰计算应不低于5×103。

　　2.2.2  对照品溶液的制备取没食子酸对照品约5 mg，精密称定，置100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，制成46.20 μg ·ml-1的溶液，即得。

　　2.2.3  供试品溶液的制备

　　取本品粉末（过2号筛）1 g，置具塞锥形瓶中，加入水50 ml，静置约12 h，加热回流3 h，滤过，取续滤液，测时再用微孔滤膜滤过，即得。

　　2.2.4  线性关系考察分别精密吸取0.046 2 mg·ml-1的没食子酸对照品溶液1.0 ，2.0 ，3.0 ，4.0，5.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。按“2.2.1”项色谱条件下，分别进样20 μl，测定各自的峰面积。
   
　　以浓度（C）为纵坐标，峰面积值（A）为横坐标，进行线性回归，得回归方程为： C = (1.514 4 e-002)×A ＋（8.091 6 e-003），r = 0.999 8。

    结果表明，没食子酸的浓度在4.62～23.10 μg·ml-1范围内与峰面积值呈良好的线性关系。2.2.5  稳定性实验
　　
　　将制备好的供试品溶液，分别于0，2，4，6，8h进样，20 μl/次，记录峰面积，结果在8 h内峰面积无明显变化，RSD=1.50%。供试品溶液在 8 h 内稳定。

　　2.2.6  精密度实验

　　取同一份对照品溶液，进样20 μl，连续6次，测得没食子酸峰面积积分值，其平均峰面积为869.9，RSD= 0.24%。

　　2.2.7 重复性实验按拟定的含量测定方法，取同一批样品（批号2）制备6份供试品溶液，分别进行测定，测得峰面积值并计算没食子酸的含量。结果平均含量为0.524 mg·g-1，RSD =1.29%，表明重复性良好。

　　2.2.8  回收率实验取已知没食子酸含量的样品6份, 每份 0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，每份分别加入没食子酸对照品溶液（0.266 mg·ml-1）1.0 ml，置水浴上蒸干，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法，制备加样回收供试品溶液，并测定每份的含量，计算回收率。结果见表1。表1  没食子酸回收率实验结果（略）

　　2.2.9  样品含量测定

　　分别精密吸取没食子酸对照品溶液及供试品溶液各20 μl，进样，记录峰面积，按外标法计算石榴中没食子酸的含量（按干燥品计算）。5批样品测定结果见表2。表2  样品中含量测定结果（略）

　　3  讨论

    供试品溶液制备时，曾考查了不同提取方法（超声与回流）、提取溶媒（水、50%甲醇和甲醇）及提取时间（2，3，4 h）对含量测定的影响。最后选择水作为溶剂，静置约12 h，加热回流3 h，结果较为满意。

    在选择色谱系统时，首先参照文献［7～9］中的没食子酸含量测定条件，以甲醇和不同浓度的磷酸（0.1%，0.2%，0.5%）及组成的不同比例；乙腈-0.1%磷酸不同比例；水-二甲基甲酰胺-冰醋酸(99.82∶0.15∶0.03)等为流动相进行实验，同时实验了不同型号的色谱柱（Sinochrom，Kromasil，Hypersil）等条件，结果以Sinochrom为色谱柱，以甲醇-0.5%磷酸（5∶95）为流动相分离效果最好。

    本研究用没食子酸作为指标性成分,对石榴进行薄层色谱鉴别，采用HPLC法进行了含量测定,并进行了方法学考察。实验结果表明，所建立的方法稳定,准确、可靠,能有效控制石榴药材质量。

【参考文献】
  　　［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草 · 蒙药卷［M］. 上海:上海科学技术出版社,2004:130.

　　［2］内蒙古自治区卫生厅.内蒙古蒙药材标准［S］.赤峰:内蒙古科学技术出版社,1986:391.

　　［3］白清云.中国医学百科全书 · 蒙医学［M］.上海:上海科学技术出版社,1992:191.

　　［4］李海霞,王剑,刘延泽. 石榴科植物化学成分及药理活性研究进展［J］.中草药,2002,33（8）:765.

　　［5］王如峰,向 兰,杜力军,等. 石榴的化学成分［J］.亚太传统医药,2006,3:61.

　　［6］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:附录ⅥB.

　　［7］王克英.石榴皮中没食子酸定性定量方法研究［J］.中国中药杂志,2005,30（15）:1171.

　　［8］陈威,来 谊,沈利君. 高效液相色谱法测定石榴皮中没食子酸的含量［J］.海峡药学,2006,18（3）：73.

　　［9］林羽. HPLC法测定止泻冲剂中没食子酸的含量［J］.海峡药学，2006，18（6）：44.