左旋咪唑诱导实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28和CD152表达的实验研究

【摘要】 　　目的观察左旋咪唑（LMS）对实验性变态反应性脑脊髓炎（EAE）大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28和CD152表达的影响，并探讨LMS诱发炎性脱髓鞘白质脑病发病机制。方法采用流式细胞术检测EAE大鼠脊髓单个核细胞上CD4，CD28和CD152的表达水平。结果LMS同时给药组和预处理的EAE组大鼠脊髓内单个核细胞上CD4和CD28的表达水平，均明显高于非LMS处理的EAE模型组。结论LMS能促进EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4和CD28的表达，提示LMS上调CD4和CD28的表达与可能LMS诱发的炎性脱髓鞘白质脑病有关。

【关键词】 左旋咪唑 实验变态反应性脑脊髓炎

　　Abstract：ObjectiveTo observe the effect of levamisole (LMS) on expressions of CD4, CD28 and CD152 on mononuclear cells in spinal cords of rats with experimental allergic encephalomyelitis(EAE), and study the pathogenesis of inflammatory demyelinating leukoencephalopathy induced by LMS. MethodsUsing flow cytometry, we detected levels of CD4, CD28,CD152 in mononuclear cells in spinal cords of EAE rats.ResultsThe expression level of EAE rats treated with LMS showed higher than that of rats treated without LMS.ConclusionLMS could exacerbate EAE by enhancing the expressions of CD4 and CD28 in spinal cords of EAE rats, and up-regulation of expressions of CD4 and CD28 may play a crucial role in inflammatory demyelinating leukoencephalopathy induced by LMS .

　　Key words：Levamisole; Experimental allergic encephalomyelitis

　　左旋咪唑(Levamisole, LMS)为四咪唑的左旋异构体，是国家和WHO抗蠕虫病基本药物，作为广谱驱肠虫药使用于临床。1971年，Renoux发现LMS具有增强免疫的作用,其作为免疫增强剂被推广用于慢性感染、皮肤疾病、自身免疫性疾病及肿瘤等疾病的免疫调节辅助治疗，长期以来被认为安全低毒。但近二十年来，国内外发现 LMS 能导致严重的中枢神经系统（CNS）功能障碍—左旋咪唑性白质脑病。LMS与LMS性白质脑病的因果关系，已被系统的药物流行病学研究所证实［1］，但其诱发该病的确切发病机制仍不清楚。实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)为CD+4T细胞介导的对髓鞘抗原的自身免疫性疾病,是研究炎性脱髓鞘白质脑病的经典动物模型。本研究通过观察LMS对EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28和CD152表达的影响，探讨 LMS 诱发的炎性脱髓鞘白质脑病发病机制。

　　1 材料

　　1.1 动物

　　雌性 SD 大鼠，5～8 周龄，体重 170～210 g。豚鼠(雌雄不拘)，质量 250～300 g， 由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。动物购回后先适应性饲养 1 周，饲养条件为室温18～28℃，相对湿度 40％～70％ ，每日12 h 光照维持，昼夜循环，自由饮水，分笼饲养。

　　1.2 药物与试剂

　　左旋咪唑购于 Sigma 公司。卡介苗（Bacille calmette guerin,BCG）、百日咳疫苗（Bordetella pertussis vaccine,BPV）购于卫生部上海生物制品研究所。淋巴细胞分离液购于美国Caltag Laboratories公司。胰蛋白酶溶液购于杭州吉诺生物医药技术有限公司。FITC标记的小鼠抗大鼠CD152抗体、APC标记的小鼠抗大鼠CD4抗体、PE标记的小鼠抗大鼠CD28抗体以及 3 种相应荧光素标记的小鼠IgG1抗体，均购自美国Pharmacia公司。

　　1.3 仪器

　　流式细胞仪美国贝克曼库尔特有限公司产品。

　　2 方法

　　2.1 抗原的制备将豚鼠经腹腔注射 100 g/L 的水合氯醛麻醉后，经主动脉灌注生理盐水至无血液流出时，小心取出脊髓，剥除脊膜，加预冷的生理盐水制成50% (W/V)的豚鼠脊髓匀浆(GPSCH)。将 GPSCH 与等体积的完全弗氏佐剂(CFA)混匀制成稳定的油包水型乳剂备用。

　　2.2 实验分组　

　　将 52 只 SD 大鼠随机分为4组。对照组7只，其余3组各15只。第1组(LMS同时给药组)：先按体重经腹腔注射NS(10 ml/kg)，2次/d，共7 d，再经四足垫皮下注射GPSCH-CFA乳剂，0. 4 ml/只，于第0，24及48小时腹腔注射LMS (10 mg/kg)。第2组(LMS预处理组)：先按体重经腹腔给SD大鼠注射LMS(10 mg/kg)， 2次/d，共7 d，再经四足垫皮下注射GPSCH-CFA乳剂，共0. 4 ml/只，于第0，24及48小时腹腔注射同量NS。第3组(EAE模型组)：先按体重经腹腔注射NS 10 mg/kg，2次/d，共7 d，再经四足垫皮下注射GPSCH-CFA乳剂，共0. 4 ml/只，于第0，24及48 小时经腹腔注射同量的NS。第4组(对照组)：先按体重经腹腔给SD大鼠注射同量的NS， 2次/d，共7 d，再经四足垫皮下注射CFA和NS制成的乳剂，共0. 4 ml/只，于第0，24及48小时腹腔注射同量的NS。4组动物均在免疫后的当日，经左腹股沟皮下注射百日咳疫苗0.1 ml(约1×109菌体)。

　　2.3 动物行为改变的观察

　　免疫后每日早晚各观察动物行为的改变1次，并详细记录，同时记录其体质量的变化，于第 25 天全部处死。

　　2.4 大鼠神经功能受损情况观察　

　　根据Kono等［2］报道的标准，定为 0～5 分：无明显异常者为 0 分，尾巴无力者为 1 分，轻微后肢无力者为 2 分，严重后肢麻痹者为 3 分，四肢麻痹者为 4 分，死亡者为5分。

　　2.5 大鼠脑、脊髓的病理检查　

　　将 SD 大鼠以100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后,用300 ml 预冷的GKN液(8 g/L NaCl，0.4 g/L KCl，3.56 g/L Na2HPO4·12H2O，0.78 g/L NaH2PO4，H2O，2 g/L葡萄糖及2 000 U/L肝素，pH 7.4)经主动脉灌流至无血液流出时，小心取出脊髓及脑组织。取一小段颈髓及部分脑组织依次经40 g/L多聚甲醛固定、石蜡包埋及常规苏木素-伊红染色(切片厚5 μm)和Luxol Fast Blue髓鞘染色(切片厚10μm)后，在光学显微镜下进行病理学检查。2.6 脊髓单个核细胞上CD4，CD28及CD152表达的检测按Pope等［3］报道的方法制备脊髓单个核细胞，并调整细胞数为5×109/L。于100 μl 单个核细胞中加入不同荧光素标记的抗CD4，CD28及CD152抗体各0.5 μg避光孵育30 min，用PBS清洗1次，再加入10 g/L多聚甲醛200 μl 待测。同时在含有100 μl单核细胞的另1管中加入三种具有相对应荧光标志的小鼠IgG1抗体避光孵育作为阴性对照。最后上流式细胞仪检测，用Cell QuestV3.2软件对获取的结果进行分析,每份样品分析20 000个细胞，减去阴性对照的结果后，以CD+4，CD+28，CD+152细胞数的百分比表示CD4，CD28，CD152的表达水平。

　　2.7 统计学处理

　　各种检测所获数据均以±s表示，组间比较采用方差分析(One-Way ANOVA)。大鼠的发病率采用Chi square检验，所有数据均采用 SPSS11. 5 统计软件进行处理。

　　3 结果

　　3.1 SD大鼠的发病及神经受损情况　

　　对照组大鼠未出现症状，体质量持续增长，活动度正常。第1，2组(即LMS同时给药组和LMS预处理组)、第3组(EAE模型组)大鼠于免疫后12 d，开始陆续发病。发病前2～3 d，出现进食减少、体重下降、毛发失去光泽甚至竖毛，并出现尾巴无力、瘫痪,继而后肢无力及瘫痪；多伴有大小便失禁，部分累及前肢。第1，2组大鼠的病情进展快，神经功能损害重，平均最大评分明显高于第3组；但发病率和发病的潜伏期无统计学意义。各组大鼠的发病及神经受损情况见表1。表1 SD大鼠EAE的发病情况及症状评分（略）

　　3.2 病理学改变对照组大鼠脑及脊髓的病理检查，未发现炎性细胞浸润及脱髓鞘改变。EAE 模型组大鼠的脑及脊髓实质内，小血管周围有较多的炎性细胞浸润，以淋巴细胞为主，典型者呈血管袖套样改变，髓鞘染色发现局灶性脱髓鞘。LMS同时给药组和LMS预处理组中炎性细胞的浸润及脱髓鞘改变更明显，可见到较多的血管袖套样改变，神经细胞肿胀、变性、坏死，并可见胶质细胞增生、小结节形成等。

　　3.3 EAE大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28，CD152的表达　EAE模型组 SD 大鼠脊髓内单个核细胞上CD4的表达最高，CD28的表达也较高，而CD152的表达水平最低。LMS 同时给药组和 LMS 预处理组大鼠脊髓内单个核细胞上CD4，CD28的表达水平较 EAE 模型组明显增高，有显著统计学差异；而CD152的表达无明显变化见表2。表2 EAE大鼠脊髓单个核细胞上CD4，CD28及CD152的表达（略）

　　4 讨论

　　EAE是CD+4T细胞介导的自身免疫性疾病。T细胞的活化需要两个刺激信号：第 1 信号为T细胞表面的 TCR/CD3 复合物与抗原提呈细胞上MHC-Ⅱ类抗原及抗原肽相结合；第 2 信号又称协同刺激信号，为T细胞上的协同刺激分子与APC表面的配体相结合所提供。虽然还有4-1BB等其它协同刺激分子参与T细胞的活化和增殖，但CD28是诱导T细胞的活化的重要协同刺激分子，而且可能优先诱导CD4+T细胞活化。CD28/B7协同刺激途径激活可明显促进IL-2合成，上调抗凋亡分子Bcl-xL，促进T细胞活化,促进EAE的发病。CD28-/-或CD28肽类似物可干扰其与配体结合明显抑制EAE的发病［4］。

　　我们发现，急性 EAE 大鼠病理改变主要为脑、脊髓实质内小血管周围炎性细胞的浸润，典型者呈血管袖套样改变，髓鞘染色可发现局灶性脱髓鞘。脊髓提取的单个核细胞(主要为淋巴细胞)中以CD4+细胞为主，支持EAE主要为CD4+T细胞介导的以中枢神经系统炎性脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。在给予GPSCH-CFA致敏的基础上，同时给予10 mg/kg的 LMS 后可明显加重EAE大鼠的症状，平均最大评分明显增高(P＜0. 01)。本研究首次发现，给予 LMS 预处理也能加重 EAE 大鼠的症状和病理改变。LMS 同时给药及 LMS 预处理组均可明显促进 SD大鼠 EAE 急性期脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达，而对CD152的表达无明显影响，故CD4+/CD152+细胞的比值升高。与 EAE 模型组相比较，LMS同时给药组及LMS预处理组大鼠中CD28+和CD4+细胞数增加近 1 倍，与其神经受损的情况及病理改变相一致。LMS作为一种免疫刺激剂，能诱导T细胞活化，增加CD4的表达，提高细胞免疫水平［5］。CD28表达的增加，通过CD28/B7-1或B7-2协同刺激途径，可促进更多T细胞活化增殖，减少其凋亡，并促进其分泌更多的促炎细胞因子(如IL-2)等，进一步加重 EAE 的炎症过程。

　　以上表明， LMS 能上调急性期 EAE 大鼠脊髓内单个核细胞上CD28和CD4的表达，提示其在中枢神经系统自身免疫性疾病中具有增强免疫病理的作用，可能是其诱发炎性脱髓鞘白质脑病发病机制中的重要环节。

【参考文献】
　　［1］周元瑶.药物流行病学［M］. 北京:中国医药科技出版社,1996:400.

　　［2］Kono DH, Urban JL, Horvath SJ,et al .Two minor determinants of myelin basic protein induce experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice［J］.J Exp Med,1988,168(1):213.

　　［3］Pope JG, Karpus WJ, Vanderlugt C, et al. Flow cytometric and functional analyses of CNS-infiltrating cells in SJL/J mice with Theiler's virus-inducced demyelinating disease:evidence for a CD+4T cell-me-diated pathology［J］. J Immunol,1996,156(10):4050.

　　［4］Srinivasan M, Gienapp IE, Stuckman SS,et al. Suppression of experimental autoimmune encephalomyelitis using peptide mimics of CD28［J］. J Immunol,2002,169(4):2180.

　　［5］Wang KX, Zhang LH, Peng JL,et al. Effect of liniment levamisole on cellular immune functions of patients with chronic hepatitis B ［J］.World J Gastroenterol,2005,11(45):7208.