记忆障碍动物模型的制备及熟地黄对其的影响

【摘要】 　　目的探讨熟地黄的益智作用及其机理。方法对化学药品所致记忆障碍模型小鼠进行学习记忆行为实验并检测相关指标，实验动物随机分为5组，分别为:正常对照组、模型组、脑复康组(500 mg/kg) 、熟地高剂量组(9 g/kg) 、熟地低剂量组(4.5 g/kg)。结果熟地黄能够减少模型动物跳台训练期、测验期错误反应次数并延长测验期触电潜伏期；缩短模型小鼠寻找平台时间，并增加其跨台次数；降低模型小鼠脑内胆碱酯酶活性、Al3+含量，保护脑组织；并能使脑内Glu/GABA维持在正常水平。结论熟地黄对于化学药品所致记忆障碍模型小鼠具有增强其学习记忆和空间记忆能力的作用，其作用机制可能与改善中枢胆碱能神经系统功能，降低脑内Al3+含量，保护脑组织及维持脑内Glu/GABA的正常水平有关。

【关键词】 熟地黄 学习记忆 记忆障碍模型

　　Abstract:ObjectiveTo study the nootropic effect of prepared Radix Rehmanniae and its related mechanism.MethodsThe behavior changes of learning and memory disorder induced by dysmnesia were observed on mice, related indexes were detected as well.Mice were pided into five groups randomly:normal group, control group, piracetam group, prepared Radix Rehmanniae (PRR) high-dose group, PRR low-dose group.ResultsPRR could decrease the rate of mistake during training and test period, prolong the latent phase, reduce the latency of searching platform. ConclusionPrepared Radix Rehmanniae can improve the ability of learning and memory of alzheimer mice induced by dysmnesia. The mechanism may be related to reducing brain cholinesterase activity, inhibiting the accumulation of aluminium ions in brain, maintaining the normal level of Glu/GABA.

　　Key words:Prepared Radix Rehmanniae; Learning and memorizing; Dysmnesia

　　学习记忆属于高级神经活动，其基本过程可以大致分为获得（acquisition）、巩固（consolidation）和再现（retrieval）三个阶段［1］。学习和记忆既是脑的高级功能，又是极复杂的神经活动过程，相应的，学习记忆障碍的产生机制也十分复杂，涉及神经生理学、神经病理学、神经药理学、神经生化学、行为药理学等多学科的内容。根据记忆过程的生理生化基础，在进行益智药物研究中，通常在训练前或训练后不同时间给予动物采用一些化学药物，造成各种记忆障碍模型。此种模型较正常动物更能正确反映药物的作用，从而可用于益智药物的筛选或初步分析其作用机理。

　　铝元素具有神经毒性，铝中毒脑病在引起记忆障碍的同时，还导致神经元染色衰变而变性死亡，诱导神经纤维退行性变性，并引起ChAT活性降低，Ach，5-HT，NA含量下降［2］。因此，用慢性铝中毒方法复制学习记忆障碍模型较为理想，不但可以通过行为学实验直观地观察药物的益智作用，而且能进一步从影响学习记忆的多种因素探索其作用机理。

　　熟地黄为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块茎经加工炮制而成,功能补血滋阴,益精填髓。临床中,熟地黄是治疗老年健忘、记忆力减退的常用药［3］,同时,也是治疗小儿先天不足、脑髓空虚之呆钝,成人肾阴虚之善忘的首选药物之一。我们前期的药理实验［4］即从记忆的获得、巩固、再现三方面入手，分别采用跳台法训练前10 min腹腔注射东莨菪碱4 mg/kg 制备记忆获得障碍小鼠模型，24 h后测试；跳台法训练后皮下注射亚硝酸钠120 mg/kg制备记忆巩固障碍小鼠模型，24 h后测试；跳台法训练5 min，24 h后测试前30 min灌胃40%乙醇0.1 ml/10 g制备记忆再现障碍小鼠模型。通过这些记忆障碍模型观察熟地黄对记忆的不同阶段的作用，结果表明熟地对上述模型动物的学习记忆能力具有明显的改善作用。可见，此行为实验结果为熟地具有补肾生髓，益智健脑作用提供了一定的客观依据。我们进一步对熟地黄对AlCl3所致记忆障碍模型小鼠记忆力的影响及其机理进行了研究。现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 试剂与药品三氯化铝 (AlCl3 ) ,广东台山化工厂；乙酰胆碱酯酶（AchE）试剂盒,总蛋白试剂盒,南京建成生物工程研究所提供。谷氨酸(Glu) ,北京邦定泰克生物技术公司提供；γ－氨基丁酸(GABA),(Sigma产品)，上海试剂公司提供。 熟地黄, 地黄Rehmannia glutinosa Libosch. 的干燥块茎,购自河南省武陟县药材公司,一等品,按《中国药典》(2000 年版,Ⅰ部)酒炖法制成熟地黄，水煎，过滤，浓缩至1∶1，4 ℃保存备用。脑复康:东北制药总厂,研成粉末,1%吐温-80助溶,生理盐水配制成25 mg/ml 药液备用。

　　1.1.2 动物昆明种小鼠，体重18～22 g，雌雄兼用。

　　1.2 方法

　　1.2.1 造模及给药方法昆明种小鼠,雌雄各半,随机分为5组，分别为:正常对照组、模型组、脑复康组(500 mg/kg) 、熟地高剂量组(9 g/kg) 、熟地低剂量组(4.5 g/kg) ，每组20只动物。各给药组给予相应药物, 正常组、模型组灌胃生理盐水,灌胃体积均为0.2 ml/10 g体重,1次/d,至实验结束。给药同时,除正常对照组外,其余各组均灌胃AlCl3 4 mg/d,连续90 d。

　　1.2.2 跳台实验依文献［5］方法测定小鼠训练期错误反应次数、测试期错误反应次数和测试期触电潜伏期。

　　1.2.3 Morris水迷宫实验依文献［6］方法测定小鼠训练期寻找平台潜伏期及测试期撤除平台后跨越原平台相应位置次数。

　　1.2.4 胆碱酯酶活性检测跳台实验结束后，断头处死各组动物，迅速剥离大脑，将大脑沿矢状缝分成左右半球，取左侧大脑在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，按胆碱酯酶测定试剂盒说明书测定胆碱酯酶活性。

　　1.2.5 铝离子(Al3 + ) 含量测定跳台实验结束后，断头处死各组动物，迅速剥离大脑，取右侧大脑干燥，称重，采用等离子体反射光谱法测定Al3 +含量。

　　1.2.6 谷氨酸(Glu)、γ－氨基丁酸(GABA)含量测定同前取小鼠左侧大脑，按文献方法［7］进行。

　　1.2.7 脑组织形态学观察同前取小鼠右侧大脑，按常规制作病理组织切片，HE染色，于光学显微镜下观察小鼠脑组织形态学变化，并摄取照片。

　　1.3 统计方法数据采用±ｓ表示,组间比较进行方差齐性检验及t 检验。

　　2 结果

　　2.1 对AlCl3 所致记忆障碍小鼠学习记忆能力的影响跳台实验表明，AlCl3所致记忆障碍模型组与正常对照组比较,小鼠训练期和测试期的错误反应次数均明显增多(P<0.01) ,测试期触电潜伏期明显缩短(P<0.01) 。熟地黄和脑复康组小鼠,训练期和测试期跳台错误反应次数均明显减少(P<0.01) ,测验期触电潜伏期明显延长(P<0.05) 。结果见表1。

　　2.2 对AlCl3 所致记忆障碍小鼠空间记忆能力的影响在Morris水迷宫实验中, 第1天,模型组小鼠寻找平台时间(SPL)较正常对照组显著延长(P<0.05),随着训练时间的增加,模型组小鼠的SPL 逐渐缩短,但远远落后于对照组,二者之间差距也越来越大(P<0.01)。熟地黄和脑复康组小鼠,在实验开始时SPL 就较模型组有缩短的趋势,至训练的第3天,脑复康组小鼠SPL较模型组显著缩短(P<0.05) 。随着训练时间的增加,各给药组SPL 缩短明显,与模型组之间差异更明显(P<0.01)。撤除平台后,模型组小鼠跨越原平台位置次数较正常对照组明显减少(P<0.01)，熟地黄和脑复康组小鼠跨越原平台位置次数较模型组小鼠明显增加(P<0.05)。结果见表2。

　　表1 熟地对氯化铝致记忆障碍模型小鼠学习记忆的影响（跳台法）（略）
　　
　　与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；n=20

　　表2 熟地对氯化铝致记忆障碍模型小鼠寻找平台潜伏期和跨台次数的影响（略）

　　与空白对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；n=20　2.3 对AlCl3 所致记忆障碍小鼠脑AchE 活性、Al3+ 的影响模型组小鼠脑组织中乙酰胆碱酯酶(AchE) 活性较正常组明显升高(P<0.01)，熟地黄和脑复康组小鼠,脑组织中AchE 活性显著降低(P<0.05，P<0.01)。结果见表3。模型组小鼠脑组织中铝离子(Al3+ ) 含量较正常组明显升高(P<0.01)，给予熟地黄或脑复康后,小鼠脑组织中Al3 +含量明显降低(P<0.01)。结果见表3。

　　表3 熟地对氯化铝致记忆障碍模型小鼠脑组织中胆碱酯酶活性、铝离子含量的影响（略）

　　与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；n=10

　　2.4 熟地对氯化铝所致记忆障碍小鼠脑组织中Glu、GABA含量的影响见表4。

　　表4 熟地对氯化铝致记忆障碍模型小鼠脑组织中Glu、GABA含量的影响（略）

　　与空白对照组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01；n=10

　　以上结果表明，模型组小鼠脑组织中Glu/GABA水平与正常对照组比较差异明显（P<0.01）；熟地高剂量组、熟地低剂量组、脑复康组Glu/GABA水平接近正常，与模型组比较差异显著。

　　2.5 组织形态学观察正常对照组小鼠脑组织形态结构正常，神经细胞的胞浆丰富，核膜清楚，核仁明显，神经胶质细胞核仁清晰，胞浆透亮或淡染。见图1。

　　模型组小鼠大脑主要病变位于脑皮质、海马等区域，水肿区神经细胞的胞浆和胞核界线不清，有些核围缩小或呈三角形，核仁消失，着色深染，少数神经细胞胞浆内见有空泡。见图2。神经纤维轴索肿胀、断裂或呈螺旋状。见图3。

　　熟地高剂量组、低剂量组及脑复康组小鼠脑组织的病理形态较模型组有明显改善，神经细胞个别有轻度的固缩及深染，神经纤维轴索轻度肿胀，表明其病变有所改善。见图4～6。

　　图1 正常对照组 （略）

　　图2 模型组（略）

　　图3 模型组（略）

　　图4 脑复康组（略）

　　图5 熟地高剂量组（略）

　　图6 熟地低剂量组（略）

　　3 讨论

　　实验结果表明,熟地黄具有改善AlCl3 所致记忆障碍模型小鼠学习记忆和空间记忆能力的作用,为熟地黄临床用于智力障碍疾病的治疗提供了实验依据。中枢胆碱能神经系统在学习记忆中具有十分重要的作用,被认为是构成学习记忆的重要神经通路［8］。本实验观察到，熟地黄具有改善AlCl3 所致记忆障碍模型小鼠学习记忆能力的作用,同时又能明显抑制小鼠脑中AchE活性,说明熟地黄改善学习记忆作用与降低模型小鼠脑组织中AchE 活性,维持脑内Ach 含量,改善中枢胆碱能系统功能有密切关系。

　　研究表明,铝的毒性作用可引起β- 淀粉样前体蛋白(β- APP) 在脑内神经元的过度表达,进而继发引起β- 淀粉样蛋白(β- AP) 在脑内神经元的沉积,从而阻碍了神经元之间的正常突触活动,引起学习记忆能力的下降［9］。本实验采取氯化铝灌胃成功复制记忆障碍小鼠模型,给予熟地黄后,不仅改善了模型小鼠的学习记忆能力,又能显著降低模型小鼠脑组织中铝离子含量。病理形态学观察也表明熟地黄对于记忆障碍小鼠脑组织具有保护作用。

　　中枢神经系统内氨基酸递质可分为兴奋性和抑制性两类, Glu 属于前者, GABA 属于后者。一般认为,Glu 对正常动物或不同记忆障碍模型动物的学习记忆有改善作用［10］,但另一方面,脑内Glu 及类似物水平过高可产生神经毒性,对脑功能有不利影响［11］ 。另有研究表明,动物在训练后,脑室内注入GABA 可加强学习［12］功能。以上事实提示,脑内Glu 和GABA 共同调节着学习记忆功能,二者水平的过高或过低都会影响学习记忆，只有二者维持在适当水平才有利于学习记忆功能的正常发挥。本实验结果提示给予AlCl3 所致记忆障碍模型小鼠熟地黄后，有利于其脑内Glu和GABA含量维持在正常水平。

　　综上所述，熟地黄具有改善氯化铝所致记忆障碍模型小鼠学习记忆和空间记忆能力的作用，其机制可能与改善中枢胆碱能神经系统功能，调节Glu和GABA水平及保护脑组织，防止过量Al3 +对其的毒害有关。

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