Troglitazone对小鼠Ⅱ型葡萄糖载体和Ⅰ型葡萄糖载体mRNA表达的影响

【摘要】 　　目的探讨Troglitazone对小鼠Ⅱ型葡萄糖载体（mGLUT2）和I型葡萄糖载体（mGLUT1）mRNA表达的影响。方法采用分子克隆技术，将过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)和维甲酸类受体X(RXRα)及mGLUT2和mGLUT1cDNA分别克隆到表达载体pCMX和pGL3b上。PPARγ与RXRα及mGLUT2与mGLUT1克隆载体转染NIH 3T3细胞，处理或不处理Troglitazone，应用荧光素酶活性测定法及RNA印迹等方法测定Troglitazone对mGLUT2和mGLUT1重组体荧光素酶活性调节及对mRNA表达的影响。结果Troglitazone可激活mGLUT2和mGLUT1重组体荧光素酶的活性，并且可增加mRNA的表达水平。结论Troglitazone可增强mGLUT2和mGLUT1的表达，可能参与PPARγ对mGLUT2和mGLUT1的调节过程。

【关键词】 Troglitazone 小鼠Ⅰ型葡萄糖载体 Ⅱ型葡萄糖载体 mRNA表达

　　AbstractObjectiveTo understand the possibility of the effect of Troglitazone on mGLUT2 and mGLUT1 mRNA expression. Methods PPARγ , RXRα and mGLUT2 and mGLUT1 cDNA were cloned into pCMX and pGL3b expression vector. The recombinant DNA transfected into NIH 3T3 cells, treated Trogiltazone or not. The mGLUT2 and mGLUT1 activity and mRNA expression were determined by the Trogiltazone through PPARγ activation with luciferase assay and Northern blot.ResultsTroglitazone activated the mGLUT2 and mGLUT1 activity and increased the mGLUT2 and mGLUT1 mRNA expression through PPARγ activation. ConclusionTroglitazone perhaps binds to the regulations on mGLUT2 and mGLUT1 by PPARγ.

　　Key words Troglitazone; mGLUT; mRNA expression

　　mGLUT2在胰岛、肝脏等组织中表达，mGLUT1在脂肪、肌肉等多种组织中表达，参与各组织吸收葡萄糖的过程。据报道，GLUT2和GLUT1在多种病理状态下有较高水平的表达，但机理不详。Troglitazone作用靶点是一种核转录因子，即过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）γ，PPARγ和配体结合而激活后，与维甲酸类受体X(RXRα)形成二聚体，再结合于PPARs反应元件(PPRE)上而发挥转录调控作用。PPRE存在于许多编码与糖代谢与脂类代谢相关的蛋白质的DNA上游序列。为了探讨Troglitazone 是否通过激活PPARγ参与mGLUT2和mGLUT1的表达调节，进而参与组织吸收葡萄糖的过程,达到降血糖的目的,本实验利用分子克隆技术构建PPARγ、RXRα和mGLUT2和mGLUT1的表达载体系统，将其转染NIH 3T3细胞后处理Troglitazone，通过荧光素酶活性测定和Northern blot等实验方法观察Troglitazone对mGLUT2和mGLUT1的活性调节及对mRNA 表达调节。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　NIH 3T3 细胞株购自 ATCC；pCRⅡ-TOPO 载体(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)；Dulbecco`s modified Eagle`s 培养液 (DMEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD,USA)；层析柱(Qiagen,Hilden,Germany)；LipofectAMINE PLUS试剂 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)；OPTI-MEN I(Life Technologies, Gaithersburg,MD, USA)；裂解缓冲液 (Promega,Madison,WI, USA)；荧光素酶测定试剂 (Promega,USA)；TRIzol 试剂 (Life Technologies, Gaithersburg，MD，USA)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 重组体的构建

　　mGLUT2启动子的 5' 侧翼-732碱基区间利用两对引物 (上游引物： 5'-CAT TGC TGG AAG AAG CGT ATC AG-3'，下游引物：5'-GGA GAC CTT CTG CTC AGT CGA CG-3') ,mGLUT1启动子的 5' 侧翼-1227碱基区间利用两对引物(上游引物： 5'-GAC TGA ATT TGT GAA-3'，下游引物：5'-TCG AAG CTC TAG CTG TGC-3'),内参GAPDH (上游引物： 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'，下游引物：5'-GGA GAC CTT CTG CTC AGT CGA CG-3')用PCR扩增后将扩增片段插入到 pCRⅡ-TOPO 载体。pCRⅡ-mGLUT2-732用 KpnI/BamHI内切酶内切后将片段亚克隆到KpnI/BamHI内切的 pGL3b 载体,构建重组体pmGT2,pCRⅡ-mGLUT1-1227用 KpnI/EcoRI内切酶内切后将片段亚克隆到KpnI/EcoRI内切的 pGL3b 载体,构建重组体pmGT1。用相同的方法构建重组体 pCMX-PPARγ (Pg), pCMX-RXRα (Ra)。利用DNA 碱基序列测定法确定重组体的序列。

　　1.2.2 瞬间转染方法及荧光素酶活性测定

　　质粒DNA利用层析柱提取纯化。细胞培养直至细胞密度达到1×106细胞/孔。 细胞经过20 h培养吸附过程后，利用LipofectAMINE PLUS试剂进行转染。3 h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加Troglitazone（1μg/ml），细胞继续培养18h，然后用裂解缓冲液裂解细胞，经离心沉淀除去细胞沉淀后收集上清液并进行荧光素酶活性测定。蛋白定量用Bradford 法测定。荧光素酶活性和裂解液的蛋白浓度之比用作荧光素酶相对活性。每个转染实验都进行3组3次实验。

　　1.2.3 RNA印迹法

　　从实验组和对照组的NIH 3T3 细胞中提取总RNA 利用TRIzol 试剂。20 μg总RNA 在含有5%甲醛的1%变性琼脂糖中进行电泳，然后将RNA 转移到尼龙膜上并UV交联。尼龙膜在杂交缓冲液中进行预杂交，然后在65℃下与mGLUT2,mGLUT1及G3PDH的探针(上游引物末端标记P32)2 h杂交。杂交完毕后尼龙膜在37℃下用2×SSc，0.1%SDS（高盐洗液）15 min2次冲洗，然后用0.2×SSc，0.1%SDS（低盐洗液）冲洗。 冲洗后尼龙膜放置在胶片下，-70℃过夜。GAPDH 作为内参对照。

　　1.3 统计学处理

　　转染实验都进行3次独立的实验，每1次都进行3组转染实验。数据用均数±标准差表示，并用t检验分析。　2 结果

　　2.1 Troglitazoen在NIH 3T3 细胞中激活mGLUT2和mGLUT1活性

　　为了确定Troglitazone是否能够调节mGLUT2和mGLUT1活性，mGLUT2和mGLUT1分别和PPARγ及RXRα重组体共转染NIH 3T3细胞，3h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加Troglitazone（1μg/ml），细胞继续培养18h，测定Troglitazone对mGLUT2和mGLUT1活性的影响。结果表明，pmGT2的活性在PPARγ和RXRα的作用下可部分增加，在相同条件下处理Troglitazone、pmGT2活性可增加7倍，pmGT1的活性在PPARγ和RXRα的作用下可部分增加，在相同条件下处理Troglitazone、pmGT1活性可增加3倍，说明Troglitazone可激活mGLUT2和mGLUT1 的活性。见图1 。

　　CONT：对照组；PgRa：PPARγ及RXRα转染NIH 3T3 细胞；

　　PgRaL：PPARγ及RXRα转染NIH 3T3 细胞后，处理Troglitazone

　　2.2 NIH 3T3 细胞中Troglitazone可调节mGLUT2和mGLUT1 mRNA 表达

　　转染pCMX， PPARγ，RXRα， PPARγ，RXRα并处理Troglitazone的RNA印迹法。实验结果均显示在in vivo条件下，Troglitazone可增加mGLUT2和mGLUT1 mRNA的表达。见图2。

　　3 讨论

　　Troglitazone作为一种口服药物对降低血糖有比较好的疗效。这类药物的作用靶点是一种核转录因子，即过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）［1］，其亚型PPARγ(1，2型)是一类核转移因子，PPARγ和配体结合而激活后,与维甲酸类受体X(RXRα)形成二聚体，再结合于PPARs反应元件(PPRE)上而发挥转录调控作用。PPRE存在于许多与糖代谢与脂类代谢相关的蛋白质中［2］。当PPARγ和其配体结合后这种效果更为显著。Troglitazon是PPARγ的选择性激活剂，不仅可以通过激活PPARγ而降低血糖，并可增强胰岛素敏感性，对II型糖尿病有较好的疗效。

　　GLUT2在胰岛、肝脏等组织中表达，这种载体对葡萄糖非常敏感［3］。GLUT1可在生物体的多组织中表达。有研究报道在3T3-L1脂肪细胞和L6肌肉细胞当中处理胰岛素可引起GLUT1在这些组织中表达并且可使葡萄糖达到体内稳态［4～6］。进一步的研究结果表明GLUT1虽然在动物糖尿病模型和糖尿病患者的组织样品种的表达不十分明显，但处理胰岛素后GLUT1 mRNA的表达水平有明显的提高［7］。为了观察Troglitazone对mGLUT2和mGLUT1表达的影响，进而探讨这两种载体在各种组织中的协同表达，达到降低血糖的目的。本实验通过DNA克隆，转染，荧光素酶活性测定及RNA印迹法等实验测定mGLUT2和mGLUT1的活性及mRNA的表达，实验证明Troglitazone可以提高mGLUT2和mGLUT1的活性，并可以使mGLUT2和mGLUT1的 mRNA表达增高。根据以上结论，可以得出Troglitazone可增加mGLUT2和mGLUT1的表达，可能提高胰岛素对mGLUT2和mGLUT1的调节，并导致生物组织中的葡萄糖稳态。

【参考文献】
　　［1］Lehmann JM, Morre LB, Smith-Oliver TA. An antidiabetic thiazolidinedion is a high affinity ligand for peroxisome proliferator-activated receptor γ［J］. J Biol Chem， 1995， 270(22)：12953.

　　［2］EL-ack AK, Hamm JK, Pilch PF. Reconstitution of insulin-sensitive glucose transport in fibroblasts requires expression of both PPAR gamma and C-EBP alpha［J］.J Biol Chem，1999，274(12)：7946.

　　［3］Higa M,Zhou YT,Ravazzola M,Baetens D,Orci I,Unger RH.Troglitazone prevents mitochondria alterations,beta cell destruction,and diabetes in obese prediabetic rats［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:11513.

　　［4］Flores-Riveros JR, McClenithan JC, Ezaki O, Lane MD. Insulin down-regulates expression of the insulin-responsive glucose transporter(GLUT4)gene:effects on transcription and mRNA turnover［J］.Proc Natl Acad Sci USA ，1993，90:512..

　　［5］Pai J, Guryev O, Brown MS, Goldstein JL.Differential Stimulation of Cholesterol and Unsaturated Fatty Acid Biosynthesis in Cells Expressing Inpidual Nuclear Sterol Regulatory Element-binding Proteins［J］.J Biol Chem， 1998， 273: 26138.

　　［6］Pardridge WM, Triguero D, Farrell CR. Down regulation of blood-brain glucose transporter in experimental diabetes［J］.Diabetes， 1990，39：1040.