简介：摘要目的应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型，设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3，制备AAV，病毒滴度达1～4×1013 GC/ml；感染WD肝细胞，72 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出其中活性最高者sgRNA1，构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT，应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞，测序和T7E1酶切检测模板修复效率；用HT特异性引物行PCR，验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。结果Sanger测序结果显示，sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%]，与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%]，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用HT进行基因修正，能检出特异性修正后的ATP7B基因；二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。结论AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

简介：摘要目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型，设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003，应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞，48 h后提取基因组DNA，聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率，筛选出效率最高者crRNA001，并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板；用crRNA001和ssODN共转染肝细胞，模板特异性引物行PCR，验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示，crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后，模板特异性引物行PCR，能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带；二代测序结果显示，ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率，相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因，为进一步的体内实验提供理论和实验基础。