简介:目的构建以rAAV为载体、GFP为报告基因和HIF-1α为靶基因的RNA干扰。方法提取人基因组DNA,PCR扩增人H1启动子,插入载体质粒pAAV-hrGFP的CMV启动子前方MluⅠ单克隆位点,构建成pH1—hrGFP;根据HIF-1α的有效干扰位点,合成两条分别为58bp互补的寡核苷酸链,通过体外退火形成双链,然后插入pH1-hrGFP的H1启动子尾部XbaⅠ和MunⅠ位点,构建成pH1—siRNA;将载体质粒pH1-siRNA和辅助质粒pRC、pHelper共转染HEK293细胞,反复冻溶后收集上清,浓缩纯化,电镜观察病毒形态和ELISA法测定病毒滴度。结果构建的pH1-hrGFP质粒,通过酶切、PCR检测以及测序鉴定均正确;构建的pH1—siRNA,通过酶切及测序鉴定也正确;包装的rAAV经电镜检测形态正常,滴度达1.2×10^12v.p/mL。结论成功构建了rAAV介导的HIF-1α—RNAi表达载体,为今后的体内外试验奠定了基础。