简介：目的：基于大肠杆菌质粒pMMB207,构建贝氏柯克斯体穿梭载体,建立贝氏柯克斯体转化系统。方法：利用PCR分别扩增eGFP基因、Kan~R抗性基因、贝氏柯克斯体组成型表达启动子P311和P1169等4段序列,然后用融合PCR技术将4段序列融合为P311-eGFP-P1169-Kan~R串联序列,经KpnⅠ和XhoⅠ酶切后,连接至经同样双酶切的pMMB207骨架上,构建穿梭载体p207-GK;将穿梭载体电转化至贝氏柯克斯体,用ACCM-2培养基进行传代培养或感染BGM细胞;利用倒置荧光显微镜观察eGFP基因的表达,传代至eGFP基因高表达时,用半固体平板培养法克隆分纯贝氏柯克斯体转化株。结果：构建了贝氏柯克斯体穿梭载体,获得了稳定表达eGFP的贝氏柯克斯体转化株,并完成了克隆分纯。结论：建立了完整的贝氏柯克斯体转化系统,为后续用遗传学方法研究贝氏柯克斯体奠定了基础。

简介：反思当下语文教学改革,取得了不少经验,但也存在不少问题。让一些师生颇感疲惫。语文该怎么教?《普通高中语文课程标准》(实验)的试行如一股春风吹进课堂,为我们语文教学改革指明了方向。本文试从回归人文和走出课堂两角度分析新课标下的语文教学,以探前路。

简介：小组合作学习制度在班级管理中的运用过程中,是需要多种方式去实施,在实际情况下,尽快的调整管理的方法,小组合作学习的动力核心是竞争,小组合作学习的方法之所以先进并且能够促进班级管理,在于调动了学生的学习积极性,提高竞争意识,学生在小组中要展开竞争,然后小组之间要竞争,最后演变到班级竞争,从而实现良好班风的形成.

简介：在我们日常生活中,电梯是必备的运载装置。以某高校为例,由于同学多,使用电梯时间集中,教学楼和宿舍经常出现乘坐电梯不便(拥挤、等待时间长)的情况发生,导致运输不畅[1]。面对这种情况,怎样合理安排电梯运载学生以缓解等待时间长和拥堵的情况就非常重要了。本文主要提出调度模型使得调度达到最佳。我们选取的评价指标为电梯运行的总时间。

简介：目的：构建猪α-1，3-半乳糖转移酶（GGTA1）基因的正负筛选打靶载体。方法：以原代猪胚胎成纤维细胞基因组DNA为模板，采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因的2条片段；以长约2kb包含部分第9外显子的片段为同源短臂，在XbaI和ClaI位点插入pLoxP质粒正筛选标记neo基因的3’端；以长约5．4kb包括部分第8外显子、全部第8内含子及部分第9外显子的片段为同源长臂，于NotI位点插入该质粒中聊D基因的5’端；2．7kb的负筛选标记船基因位于载体中同源短臂的3’端外侧。结果与结论：酶切、PCR及测序结果表明，同源臂被正确连接至质粒pLoxP，成功构建了猪GGTA1基因正负筛选打靶载体pSL／GT。

简介：在实践中,力求从建构教学模式的角度构建一个四阶段的对话教学模式,以便将对话教学的理论具体化为教学实践中的可操作之物,增强对教学过程的指导性,避免教学实践中的盲目无序。本文首先对高中语文对话教学的现状分析,最后阐述了语文对话教学模式的实现策略。当然,语文对话教学模式的开展还需要很多条件,最主要的是:改变教学观念,提高教师水平:优化教学环境,力促学生主动参加。

简介：PCR扩增了集胞藻PCC6803的slr1761基因,进一步以PGEM-T为载体将其克隆到大肠杆菌中,构建了P1761质粒。通过DNA体外重组,以卡那霉素抗性基因插入目的基因片段,构建了既含目的基因上游及下游序列、又携带选择性标记卡那霉素抗性的PK1761质粒。该质粒转化野生型集胞藻PCC6803细胞,利用同源重组原理获得了能在含卡那霉素的培养基上正常生长的基因敲除突变株。对该突变株基因组DNA进行PCR扩增,验证了其基因结构的正确性。

简介：目的：从真核细胞中获得骨形态发生蛋白2（BMP2）编码基因，构建其真核表达载体并进行鉴定。方法：提取人HeLa细胞总RNA，经反转录后用特异性引物扩增BMP2编码区，连接至pcDNA3．1载体，筛选阳性克隆并进行功能学鉴定。结果：反转录PCR获得1100bp的片段，经分子克隆后鉴定序列与BMP2一致，并且在真核细胞中能够诱导Smad1／5／8的磷酸化。结论：构建了真核表达载体pcDNA3．1-BMP2并验证了其体内功能，为后续探讨BMP2在骨发育中的作用机制打下基础。

简介：目的:构建人角质细胞生长因子2(KGF-2)基因真核表达载体,探索KGF-2的上皮细胞迁移功能。方法:以人乳腺cDNA文库为模板,PCR扩增KGF-2基因片段,将其插入pXJ-40-myc,经双酶切和测序验证后,将重组质粒转染HEK-293T细胞,采用Western印迹检测重组蛋白;转染人肠上皮细胞FHC,采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果:PCR扩增获得627bp的DNA产物,插入pXJ-40-myc载体,双酶切及测序结果证明重组质粒含有目的序列;转染HEK-293T细胞,Western印迹检测到相对分子质量约23×10^3的目的蛋白;细胞划痕实验显示,转染Myc-KGF-2的FHC细胞较未转染或转染空载体的细胞迁移能力强。结论:构建了人KGF-2基因真核表达载体,并验证了其促进细胞迁移的功能。

简介：生物是初中阶段重要的基础课程,是教学的重点.研究表明,初中生物教学实践中,注重学生学习兴趣的激发,往往可获得事半功倍的教学效果.鉴于此,本文对初中生物教学中如何激发学生的学习兴趣进行探讨,以供参考.

简介：目的：构建汉滩病毒包膜糖蛋白基因的真核表达载体，并加入可增强免疫应答效应的细胞因子CD40L基因，检测其可否在真核细胞中表达。方法与结果：参照GenBank中汉滩病毒M基因和小鼠CD40L的全基因序列设计引物，通过聚合酶链反应（PCR）获得M和CD40L基因片段，将其与pCI—neo载体相连，测序证实该载体构建成功后，将此真核表达载体以脂质体转染法转染至哺乳动物细胞CHO—K1中，利用间接免疫荧光法（IFA）检测发现M基因和CD40L基因可以同时表达于CHO-K1细胞中。结论：构建了带有CD40L基因的汉滩病毒包膜糖蛋白重组质粒并获得表达，为深入研究汉滩病毒感染后包膜糖蛋白引起的特异性免疫应答规律奠定了实验基础。

简介：目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3~6s)升至10倍,200s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5~8s),并且回落更慢,300s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。

简介：目的：获得抑制效果好的泛素C端水解酶LI（UCH—L1）基因小干扰RNA（siRNA）干扰载体。方法：根据Gen—Bank中大鼠UCH—L1基因序列设计并合成4对siRNA寡核苷酸序列，将4对寡榱苷酸序列退、k成双链后分别插入siRNA表达载体pcDNA6．2-GW／EmGFP—miR中构建4个siRNA表达质粒，测序鉴定后将4个siRNA表达磺牝分别转染HEK293细胞，利用Western印迹和qPCR方法检测干扰效果；将干扰效果最好的质粒包装成腺病毒，感染大汛血管平滑肌细胞（VSMC），并采用TNF-a干预诱导UCH—Ll表达升高，Western印迹验证干扰效果。结果：测序分析证实4对siRNA寡核苷酸序列分别插入siRNA表达载体pcDNA6．2-GW／EmGFP—miR；qPCR检测与Western印迹均表明第3号siRNA表达载沐对UCH—Ll表达的抑制程度最高，将其包装成腺病毒并转染VSMC能显著抑制TNFd湾导的U（：H—I。l表达升高。结论：构建并筛选出干扰效果好的UCH—LlsiRNA干扰载体。

简介：以pBRTM/HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5a、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ/EcoRⅠ、XhoⅠ/HindⅢ和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP-N3中,构建重组质粒pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-△ISDR.对重组质粒进行酶切分析和序列测定.将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定.经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR.RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达.以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-△ISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCVNS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料.

简介：为适应经济社会快速发展的需要,加快技能人才队伍建设,已经到了刻不容缓的地步。根据《国家中长期人才发展规划纲要(2010—2020)》、《湖北省国民经济和社会发展第十二个五年规划纲要》和有关专项规定,到2017年,培养开发紧缺技能人才50万人,其中紧缺高技能人才10万人。然而却出现一方面社会对人才的需求量大,另一方面,据调查40%以上的园林中高职学生毕业后却并没有从事园林行业。就人才知识、能力、素质的结构来看,究其主要原因还是学校的培养方向与社会需求还存在着明显的脱节。因此,如何进行一体化教学改革,提高人才培养质量是职业院校的当务之急。

简介：运用AHP分析法分析高职学生顶岗实习的综合表现,是目前各个学校力争完善的学生综合评价方法。本文就AHP层次分析法的最核心点——指标体系的建立进行了讨论,提出在运用AHP层次分析法评价高职院校顶岗实习综合效果的过程中,由学校、学生、实习单位、指导教师构成综合评价指标体系,完善考评系统

简介：目的：构建能介导结缔组织生长因子（CTGF）基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法：以大鼠CTGF基因为靶序列，设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸，构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF，酶切及测序分析正确后，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞，进行病毒包装，得到腺病毒载体Ad．H1-CTGF，用该载体感染HSC-T6细胞，观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果：构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确；包装的病毒载体滴度为4×1010PFU／mL，感染HSC-T6细胞后，Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论：构建的腺病毒载体Ad．H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达，为抗纤维化研究提供了有力的工具。

简介：目的：利用Red系统构建肠出血性大肠杆菌O157：H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法：选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因，根据NCBI上相应的序列，设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂，经PCR扩增，构建到相应的载体，最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段，在Red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组，从而把sRNA基因从基因组上置换下来，之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论：构建了出血性大肠杆菌O157：H7的sRNA基因E40的缺失突变株，为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157：H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。

简介：在真核生物的基因中，mRNA选择性剪接现象十分普遍。mRNA选择性剪接导致一个基因多转录本的产生，被认为是高等生物增加蛋白质多样性的主要机制，且已发现与许多人类疾病密切相关。发现这些转录本的选择性剪接位点、新的外显子和外显子组合，乃至获得这些剪接变异体的完整克隆，对于基因功能的深入研究十分必要。简要介绍了几种在mRNA水平探索选择性剪接的方法。

简介：急性闭合性跟腱损伤是临床上一种较常见的运动创伤,据文献统计,跟腱损伤的发病率为0.18‰,而且在逐渐上升。然而在运动过程中,特别是剧烈弹跳的一瞬间,跟腱容易发生断裂。跟腱损伤后病人需长周期的治疗,以此给社会带来了巨大的经济损失和自身健康并发症。因此,跟腱损伤的治疗和康复显得尤为重要。很多学者已经做出了有益的探索,也取得了显著的成果,但总的来说方法很多,问题却没有得到解决,对闭合性跟腱断裂尚未形成一套明确有效的治疗方案。本文就急性闭合性跟腱断裂治疗的有关研究进展作以下综述,以期待对临床实践有所帮助。