简介:目的:构建人血清白蛋白(hSA)与小鼠乳清酸蛋白(mWAP)调控序列的杂合基因座。方法与结果:在pBR322载体上连入预先无痕连接的3对同源臂,利用基于Red同源重组系统的缺口修复(gap-repair)技术,分别对8kb的mWAP基因座3′调控区、16kb的hSA基因组编码序列及13kb的mWAP基因座5′调控区进行连续3次基因抓捕,最终将全长37kb的乳蛋白杂合基因座构入pBR322载体;通过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,确定mWAP基因座中的编码序列被精确地置换为hSA的基因组编码序列。结论:构建了整合有mWAP-hSA杂合基因座的pBR322载体,为研究杂合基因座在乳腺中的表达效果及置换型基因座表达的可行性提供了数据。
简介:目的:构建一个牛dSl酪蛋白调控序列指导人溶菌酶(hLYZ)基因组序列的杂合基因座。方法:采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中,构成能进行3次连续基因抓捕的载体,利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术,分别抓捕牛aSl酪蛋白3’端调控序列(9kb)、hLYZ基因座序列(5kb)、牛axSl酪蛋白5’端调控序列(20kb),使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上,形成牛oLSl酪蛋白一hLYZ杂合基因座。结果:实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定,验证了hLYZ的基因组序列对牛仪S1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论:这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。
简介:由于原核细胞mRNA3'端不存在ploy(A)结构,因而原核细胞DDRT-PCR引物设计不同于真核细胞。尽管不能根据oligo(dT)设计引物,但利用全基因中高度分散重复的短序列或回文序列却能有效克服mRNA分子结构的影响,最大限度地扩增全长cDNA;并且这2种引物设计方法还可以提高RNA指纹图谱的重复性,降低反应的假阳性,从而为原核细胞DDRT-PCR引物设计提供新的思路。
简介:目的:选择发酵系统中各可控因素的最佳水平组合,从而减少各种干扰的影响,以获得稳健的赖氨酸产量。方法:利用田口法的内外表与Box性能规则优化赖氨酸发酵条件。结果:通过实验得知,转速、硫酸铵和葡萄糖浓度对发酵影响较大;结果稳定的最优发酵条件为初始葡萄糖浓度为80g/L、硫酸铵浓度为42g/L、转速为225r/min、初始pH值为6.7、接种量为8%。经实验验证,最优化发酵条件是低灵敏度的,最优目标值比较稳健。在10L自动发酵罐上培养65h,L-赖氨酸盐酸盐的产量为165.68g/L,比优化前提高了12.4%。结论:基于稳健性设计所得的最优发酵条件参数,可使目的产物产量稳定,便于生产操作。
简介:目的:设计合成新型2-喹诺酮类Polo样激酶1(Plk1)抑制剂。方法:以Plk1抑制剂ON01910为先导化合物,利用生物电子等排原理设计一系列2-喹诺酮类衍生物,用Autodock软件将该类化合物与Plk1进行分子对接和虚拟筛选,计算结合自由能;以取代的氯(溴)苄为起始原料,先后经巯基乙酸取代、双氧水氧化、与(对甲氧基)苯胺酰化,再经环合、水解制得目标化合物。结果:设计的化合物大多数与Plk1的结合自由能均比ON01910的低,结合强度高、稳定性好;合成了16个2-喹诺酮类衍生物,产物结构经1H-NMR确证。结论:所得化合物中有15个为新化合物,化合物的结构设计科学合理,虚拟筛选结果良好,为后续实体筛选和化合物结构优化提供了理论依据和参考。