简介：目的：建立检测人4型腺病毒拷贝数的荧光定量PCR方法。方法：提取本实验室构建的4型腺病毒全基因组质粒，以梯度稀释质粒为标准模板，选取人4型腺病毒六邻体区域基因设计一对特异性引物，进行SYBRGreenI荧光定量PCR扩增并制作标准曲线。结果：标准曲线为y=-4．284x＋53．468，由全基因组质粒所构建的标准曲线线性关系良好，扩增反应Ct值与拷贝数的对数呈线性关系（R2=0．999609），检出敏感度可达1×10^2拷贝/μL，且与其他几种腺病毒无交叉反应。用该方法检测4型腺病毒感染细胞2、12和24h后的病毒拷贝数，其病毒拷贝数随时间增加，与细胞病变（CPE）变化保持一致，且荧光定量PCR的测量结果稳定（变异系数〈6％）。结论：建立了检测人4型腺病毒基因拷贝数的荧光定量RT—PCR方法，该方法灵敏度高、特异性强。

简介：用Biosym公司开发的计算机辅助分子设计系统模建了鼠抗人纤维蛋白抗体Fv片断的三维结构。Fv是由重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)两个结构域组成的具有抗原结合能力的最小抗体片断。先分别模建了Vh和Vl两个结构域,然后搭建出Fv片断的整体三维结构,并对模建的结构进行了分子力学和动力学优化。对结构的合理性验证显示模建结构是合理的。本研究为鼠抗人纤维蛋白抗体Fv片断的人源化的分子设计打下了基础。

简介：根据1993年UNSCEAR报道,人类所受的天然辐射剂量中近50％来自氡及其子体。流行病学研究表明,接触高水平氡及其子体的铀矿工人肺癌发病率增高。由于大部分人类癌症起

简介：目的：构建人血清白蛋白（hSA）与小鼠乳清酸蛋白（mWAP）调控序列的杂合基因座。方法与结果：在pBR322载体上连入预先无痕连接的3对同源臂,利用基于Red同源重组系统的缺口修复（gap-repair）技术,分别对8kb的mWAP基因座3′调控区、16kb的hSA基因组编码序列及13kb的mWAP基因座5′调控区进行连续3次基因抓捕,最终将全长37kb的乳蛋白杂合基因座构入pBR322载体;通过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证,确定mWAP基因座中的编码序列被精确地置换为hSA的基因组编码序列。结论：构建了整合有mWAP-hSA杂合基因座的pBR322载体,为研究杂合基因座在乳腺中的表达效果及置换型基因座表达的可行性提供了数据。

简介：目的：经慢病毒载体介导,制备转人α血红蛋白稳定蛋白基因（ahsp）的β654地中海贫血小鼠。方法：用巢式PCR从人血DNA中获得人ahsp基因,构建含有人ahsp基因的慢病毒载体,制备假病毒,通过卵周隙显微注射手段将其导入β654地贫小鼠的受精卵,经移植至假孕母鼠输卵管,最终孕育出转人ahsp基因的β654地贫小鼠;分析小鼠体内外源ahsp基因的表达情况及其遗传稳定性。结果：共获得了8只人ahsp阳性小鼠,转基因阳性率为32%（8/25）,其中3只同时具有β654突变基因;人ahsp基因在小鼠体内的表达水平维持在小鼠自身ahsp表达量的1%左右,且可稳定遗传至子代。结论：制备了转人ahsp基因小鼠,并可遗传至子代,为在个体水平上研究α血红蛋白稳定蛋白与β地贫之间的关系提供了工具。

简介：目的：研究抗人表皮生长因子受体2（HER2）人源化单克隆抗体能否在毕赤酵母中表达,并对表达产物进行结构分析和活性测定。方法：合成抗HER2人源化单克隆抗体的全基因,构建轻重链双表达盒表达载体,转入毕赤酵母中;通过表型筛选和诱导表达实验得到抗体表达工程菌,对表达产物进行分离纯化和活性测定。结果：表达产物存在于表达上清中,摇瓶表达水平达到53.7±2.9mg/L;毕赤酵母表达的抗体的轻重链能够自发通过二硫键装配成正确的抗体结构,其中重链发生了N-糖基化;酵母表达的抗HER2人源化单克隆抗体可以抑制高表达p185erbB2肿瘤细胞SKBR-3的生长,半数有效浓度为0.17mg/L。结论：实现了抗HER2人源化单克隆抗体在毕赤酵母中的表达,为毕赤酵母表达系统成为抗体等人用剂量较大的复杂型糖蛋白的大规模、低成本制备平台提供了基础。

简介：构建了二氢叶酸还原酶（dhfr）选择基因启动子上游无增强子（cnhancer）的组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）组合突变体FrGGI真核表达质粒pZLFrGGI。将pZLFrGGI酶切线性化,采用大剂量DNA电击介导法,转染dhfr基因缺陷型中国仓鼠卵巢细胞系（CHO-dhfr-）。用氨甲喋呤（MTX）筛选转染细胞。混合加压后,挑选克隆,在1×10-7mol/LMTX压力下,得到了表达水平达1500～2500IU/106细胞·24小时的细胞株。此细胞株表达水平稳定,形态良好,倍增时间为36小时,且有进一步提高表达水平的潜能,有望发展为工程细胞株。

简介：目的：比较国产重组C225与国外已上市同类药Erbitux是否具有相似或更好的与表皮生长因子受体（EGFR）的竞争结合力及体内外抗肿瘤药效。方法：构建EGFR高表达的人结肠癌HT-29细胞裸鼠移植瘤模型,观察静脉注射国产重组C225对肿瘤生长的抑制作用,并评价其对肿瘤细胞诱导细胞凋亡和增殖的抑制作用。结果：HT-29结肠癌裸鼠移植瘤模型对单独应用的国产C225或Erbitux敏感性都很差,对单独应用CPT-11的敏感性也较差,但当国产C225和CPT-11联合应用后抗肿瘤作用大大提高,2次实验的相对肿瘤增殖率T/C（%）分别为20.0%（P〈0.05）和19.0%（P〈0.05）。对人结肠癌HT-29细胞抑制增殖和诱导凋亡作用的影响研究结果显示,国产C225与CPT-11联合疗法的凋亡指数/增生指数比,是单独使用国产C225或单独使用CPT-11的4.3倍以上。结论：在人结肠癌HT-29裸鼠移植瘤模型中联合应用国产C225和CPT-11可以抑制EGFR,对肿瘤细胞有很好的诱导凋亡作用和抑制增殖作用,这种联合疗法对于CPT-11耐受的结直肠癌具有很好疗效。

简介：目的：构建一个牛dSl酪蛋白调控序列指导人溶菌酶（hLYZ）基因组序列的杂合基因座。方法：采用本实验室发明的连续3步缺口修复技术。将6个无痕连接的同源臂插入以pBR322为载体的骨架中，构成能进行3次连续基因抓捕的载体，利用Red同源重组系统介导的缺口修复技术，分别抓捕牛aSl酪蛋白3’端调控序列（9kb）、hLYZ基因座序列（5kb）、牛axSl酪蛋白5’端调控序列（20kb），使这3个基因片段自动无痕地连接在基因抓捕载体上，形成牛oLSl酪蛋白一hLYZ杂合基因座。结果：实验经过PCR扩增、限制性内切酶酶切验证和序列测定，验证了hLYZ的基因组序列对牛仪S1酪蛋白编码基因组序列的精确置换。结论：这种修复技术为乳腺生物反应器高效表达大载体的制备提供了可行的思路及方法。

简介：目的：观察DcR3基因小干扰RNA（siRNA）对人结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤DcR3基因表达的影响。方法：建立结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型,瘤体注射脂质体与DcR3siRNA混合物,转染DcR3siRNA,免疫组织化学及RT-PCR检测观察DcR3基因的表达。结果：建立了结肠癌SW480细胞裸鼠皮下移植瘤模型;治疗后,治疗组移植瘤明显减小,空白对照组、阴性对照组肿瘤体积显著大于治疗组（P〈0.01）;各组肿瘤组织中DcR3基因均有不同程度的表达,治疗组表达程度明显低于阴性对照组及空白对照组（RT-PCRP〈0.05,免疫组化P〈0.01）。结论：人结肠癌SW480细胞在裸鼠皮下有良好的成瘤性;脂质体与DcR3siRNA混合物可特异性抑制结肠癌裸鼠皮下移植瘤内DcR3基因的表达。

简介：目的：人肌球蛋白7A（MYO7A）基因是遗传性耳聋分子筛查的候选基因之一。从已知的MYO7A非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）位点数据库中筛选可能与致病表型相关的nsSNPs位点,以提高MYO7A基因耳聋分子诊断的有效性和准确率。方法：首先,从NCBI数据中心的dbSNP数据库（dbSNP）和DeafnessVariationDatabase数据库获得MYO7A基因的SNPs数据和基因的相关信息;然后,通过SIFT、PolyPhen-2、PANTHER、PhD-SNP、MutationTaster、SNP＆GO和MutPred软件进行nsSNPs表型致病性分析,预测潜在致病位点;接着,应用ClustalX2和GeneDoc软件进行同源氨基酸序列比对,分析潜在致病的nsSNPs位点保守性;最后,应用SwissModel平台选择性地对某些突变蛋白质的三维结构进行建模,并分析结构域的变化。结果：预测出MYO7A的104个高风险致病的nsSNPs位点,包括25个已报道的耳聋相关nsSNPs位点;高风险致病的nsSNPs位点中,有42个位于肌球蛋白马达（myosinmotor）结构域,其中12个预测有致病风险的nsSNPs位点与MYO7A基因致聋的突变研究报道一致。肌球蛋白马达结构域中包含30个新预测的潜在致病性nsSNPs位点,其中仅L366P位点在7个预测软件中具有高度一致性。通过对L366P位点位点突变前后的三维模型构建,发现存在蛋白结构的改变,且同源性比对结果显示了该位点的高度保守性。结论：MYO7A的L366P为潜在高风险致病性nsSNP位点,推测该基因突变可能与耳聋表型相关。本研究所采用的分析筛选方法对MYO7A基因突变的临床筛查及其他致病基因的nsSNPs筛选具有重要的参考价值。

简介：人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种用于治疗血栓性心血管疾病的特效药物,它能激活血纤维蛋白酶原,后者使血块溶解,所以这种药物的开发为社会普遍重视。t-PA在人体血液中的含量极低,很难从天然材料中提取。如果应用转基因技术,将人t-PA基因转入动物体内,使其在乳腺中高效表达,从乳汁中提取大量的t-PA,将具有可观的经济效益和社会效益。转基因动物建立的前提条件是构建乳腺定位高效表达载体。为此,我们先将本所保存的t-

简介：目的：初步探究十五肽BPC-157调节人脐静脉内皮细胞（HUVEC）功能的信号通路作用机制。方法：首先利用生物芯片筛选BPC-157参与激活的细胞信号转导通路途径，进而通过real—timePCR证实BPC-157对候选信号通路中相关基因的mRNA表达水平的影响，最后采用Western印迹观察BPC-157对候选信号通路中相关蛋白的磷酸化水平影响。结果：10μg／mLBPC-157作用于HUVEC24h后，信号转导通路发现者芯片结果显示，与18条信号转导通路相关的96个关键基因中分别有4个基因的mRNA表达水平上调和下调，其中与MAPK信号通路相关的3个关键基因c—ns、c—Jun和Egr-1的mRNA表达水平显著性上调；低剂量BPC-157（1Ixg／mL）作用于HUVEC12h后，能够促进早期即刻基因c—ns、c—Jun和酝卜1的mRNA表达水平；10μg／mLBPC-157作用于HUVEC30min后，可明显促进ERKl／2、p38蛋白磷酸化。结论：BPC-157可能通过活化MAPK信号转导通路途径后，激活下游早期即刻基因转录，启动靶基因的表达，从而发挥促进HUVEC增殖、迁移等功能。

简介：本文作者已有的研究结果证明,完整的人干细胞生长因子(hSCGF)没有种属特异性,即可以作用于小鼠骨髓造血细胞.这一点与在Ca2+依赖糖识别结构域(CRD)缺失了78个氨基酸残基的截短分子(hSCGFβ)有所不同.本研究从hSCGF全长cDNA中完全删除了CRD结构域编码序列,进一步探讨CRD结构域的生物学功能.由于该突变体序列GC含量较高,因此将该缺失突变体序列克隆在GST融合表达载体中进行融合表达.通过低温(28℃)诱导,表达产物主要以可溶蛋白的形式存在.利用亲和层析纯化CRD结构域完全缺失的hSCGF突变体融合蛋白,通过检测重组突变分子的协同刺激造血活性有无改变来初步探讨CRD结构域在hSCGF分子中的生物学功能.研究结果表明,去掉完整CRD结构域的突变分子仍然具有造血刺激活性.据此推断CRD结构域在hSCGF分子中可能对于受体配体结合起辅助作用.