简介:目的:探索建立一种利用核酸酶免疫试验中探针的熔解温度差异检测已知突变位点的方法.方法:目的靶基因经扩增后,5'末端标记洋地黄毒苷(digoxigenin,Dig)的等位基因探针与已结合在酶标板上的扩增产物杂交,其杂交的探针-DNA二聚体的碱基错配与未错配之间存在变性温度差异.选择适宜的熔解温度进行已知突变位点的检测,并利用酶联免疫吸附试验对标记探针进行识别、放大和结果判断.结果:实验结果表明,当熔解温度为37℃时,扩增产物的加样量为5μl/孔和检测探针加入量为10pmol/孔时所测得A450值为0.800~0.923.等位基因检测探针的熔解温度为53℃,P1、P2与靶DNA结合率分别为86%和16%.当P1、P2按不同比例杂合时,其与结合率存在着明显的线性关系(r=0.9985).从8例人类乙型肝炎病毒(HBV)DNA阳性的血清标本检测中证实1例酪氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸(YVDD)突变、3例野生型,其余4例可能是杂合型突变.结论:本法具较高的检测灵敏度,且其突出的特点是能检测出标本中杂合突变所占的比例,间接反映出患者体内突变的类型和比例.这对于疾病的诊断、治疗、预后评价等都具有较高的价值.
简介:自交不亲和性是一种普遍存在于显花植物中的生殖隔离现象,可以抑制近亲繁殖而促成异交。由S-核酸酶介导的植物配子体自交不亲和机制类型的花柱S决定子基因编码的S-核酸酶进入花粉管,异花授粉下则会被花粉SCF复合体所标记泛素后被26S蛋白酶体分解,从而发生异交亲和;然而自花授粉过程中,自我的花粉SCF复合体不会泛素标记花柱S基因编码的S-RNase,从而拥有活力,分解花粉管中的RNA导致花粉管生长发生障碍,进而蛋白质合成受阻,引起自交不亲和。Cullin1是SCF复合体中的一个基因,在SCF复合体SKPl-Cullin1-Rbx1-F-box的晶体结构当中充当重要角色,该综述将主要介绍并讨论基于S-核酸酶的自交不亲和Cullin1基因的研究进展。
简介:摘要鉴于目前核酸分子检测技术逐步从临床实验室向现场检测转移的发展趋势,急需建立一种高灵敏、高特异、高效和便捷的新型核酸诊断工具来满足临床即时检测(POCT)的需要。基于规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)的检测方法是一种有前景的新型核酸检测方法。该方法中Cas效应蛋白能够识别高度特异的核酸序列,通过联合高灵敏小型生物传感器运用于POCT,在满足高灵敏性和高特异性的同时具备了检测的高效、便捷的特点。本文综述了近几年基于CRISPR/Cas技术集成小型现场分析传感器相关领域的进展,并讨论了POCT相关检测的研究前景及挑战。
简介:摘要目的构建一种太赫兹(THz)超材料传感方法用于microRNA-21(miRNA-21)的信号放大检测。方法首先构建THz超材料传感方法,并用聚丙烯酰胺凝胶电泳及zeta电位验证方法的可行性;对传感器检测条件进行优化之后,对不同浓度的miRNA-21以及其他不同的miRNAs进行检测,并与其他microRNA检测方法进行比较;最后,对该传感器的回收率进行了评价。结果在最优实验条件下,通过双链特异性核酸酶(DSN)循环识别与滚环扩增(RCA)的双重信号放大策略,该THz超材料传感器对靶标miRNA-21的响应范围为10 fmol/L至10 nmol/L,检测限为8.49 fmol/L。并且该传感器具有较好的特异性,具备了从多种miRNAs中识别靶标miRNA-21的能力,并且在商业化人血清样本中的回收率可达94.33%到115.33%。结论该THz传感器可以实现靶标miRNA-21的高灵敏、高特异性检测,具备了在miRNA相关疾病无标记诊断与早期预警的潜力。
简介:摘要目的应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型,设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3,制备AAV,病毒滴度达1~4×1013 GC/ml;感染WD肝细胞,72 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出其中活性最高者sgRNA1,构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT,应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞,测序和T7E1酶切检测模板修复效率;用HT特异性引物行PCR,验证HT掺入。组间比较采用Student’s t检验。结果Sanger测序结果显示,sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%],与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%],差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用HT进行基因修正,能检出特异性修正后的ATP7B基因;二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。结论AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。
简介:摘要从原核生物的适应性免疫机制衍生出的成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeat and associated protein,CRISPR-Cas)系统,以其特异性高、可开发性强、简单高效等特点迅速从众多具有竞争力的基因编辑技术中脱颖而出,既为体内基因编辑技术带来革命性突破,也在体外诊断领域开拓了新的方向。近年来涌现出许多快速、便携、经济、高效的基于CRISPR-Cas系统的体外诊断技术,这些技术在病原体检测方面展示出良好的性能,在肿瘤基因诊断、遗传病筛查、移植排斥反应检测等方面也具有很大潜力。此文仅就CRISPR-Cas系统的作用原理、基于CRISPR-Cas系统的检测方法以及在病原体核酸检测领域的应用进展进行简述。
简介:摘要目的应用规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统(CRISPR/Cas9)体外实验研究修正威尔森氏症(WD)基因。方法选用来源于DL近交系小鼠的Toxic milk小鼠(购自美国Jackson Laboratory公司)作WD模型,设计3个CRISPR来源的RNA (crRNA)-crRNA001/002/003,应用CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)方法转染WD肝细胞,48 h后提取基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率,筛选出效率最高者crRNA001,并设计相应的单链寡核苷酸(ssODN)修复模板;用crRNA001和ssODN共转染肝细胞,模板特异性引物行PCR,验证ssODN掺入。组间比较采用Student’S t检验。结果Sanger测序结果显示,crRNA001的编辑效率为(57.8±5.1)%。用ssODN共转染细胞后,模板特异性引物行PCR,能扩增出修正后的铜离子转运ATP酶β肽(ATP7B)基因条带;二代测序结果显示,ATP7B基因修复效率为(7.45±2.54)%。结论CRISPR/Cas9 RNP转染能达到较高编辑效率,相应的ssODN可以高效修复缺陷ATP7B基因,为进一步的体内实验提供理论和实验基础。
简介:摘要目的了解采用干扰素治疗的慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者干扰素受体(interferon-α receptor,IFNAR)、干扰素刺激基因因子3( interferon-stimulated gene factor 3,ISGF3)、双链RNA依赖蛋白激酶(double-stranded RNA-activated protein kinase,PKR)、核糖核酸酶L(ribonuclease L,RNase L)的表达水平。方法纳入2014年7月至2017年6月南昌大学第一附属医院感染科收治的41例CHB初治患者,18例给予聚乙二醇干扰素α-2b治疗,23例患者给予普通干扰素治疗。采用反转录荧光聚合酶链反应和蛋白质印迹法检测治疗前,治疗4、8、12、24周时患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR、RNase L的mRNA和蛋白质表达水平。比较治疗有效组和无效组患者上述指标的表达水平。统计学分析采用t检验。结果治疗24周时,25例患者治疗有效,16例治疗无效。治疗4周时,有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2和PKR的mRNA表达水平分别为0.748±0.129、1.169±0.125和1.047±0.091,分别高于无效组患者的0.591±0.021、0.689±0.059和0.791±0.033,差异均有统计学意义(t=-4.304、16.482、-5.346,均P<0.01);有效组患者PBMC中ISGF3和RNase L的mRNA表达水平分别为0.739±0.159和0.780±0.140,无效组患者分别为0.690±0.035和0.733±0.122,差异均无统计学意义(t=-0.160、-1.443,均P>0.05)。基线,治疗8、12和24周时,有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的mRNA表达水平均高于无效组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。基线,治疗4、8、12和24周时,有效组患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的蛋白质表达水平均高于无效组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。结论采用干扰素治疗后,CHB患者PBMC中IFNAR1、IFNAR2、ISGF3、PKR和RNase L的mRNA和蛋白质表达水平均可升高,其中IFNAR2和PKR在治疗早期(4周)即明显升高。
简介:摘要目的对血液平行筛查时采用核酸检测与酶免检测的临床效果分析。方法本次选择50份献血者的标本进行分析,对其ELISA检测结果(HBsAg、抗-HCV、抗-HIV)和NAT检验结果进行分析。结果检验后,50份标本中有37份为NAT阳性,占74.00%,ELISA阳性有25份,阳性率为50.00%,NAT和ELISA阳性的有23份,占46.00%,ELISA阴性,NAT阳性的有18份,占36.00%,鉴别出5例HBV-DNA和1例HBV-RNA;ELISA阳性,NAT阴性的有3份,占6.00%。结论平行筛查血液能够及时发现患者的疾病,而在筛查中给予核酸检测与酶免检测能够相互补充,同时可以显著缩短检测的周期,保障血液的及时供应,为临床提供便利的服务。
简介:【摘要】:目的:探讨核酸检测以及酶免检测平行筛查血液的意义。方法:选取2023年1月-2023年12月本院的1000例献血者血液样品作为研究对象,分别对上述血液样品展开针对乙肝表面抗原、抗 HIV、抗 HCV 等项目的核酸检测与酶免检测,比较最终临床检验结果。结果:核酸检测阳性率、酶免检测阳性率分别为26.00%与 15.00%;核酸检测以及酶免检测阳性率、酶免检测阴性和核酸检测阳性占比分别为9.10%、 15.00%;在酶免检测阳性标本中核酸检测阴性占比为7.00%。结论:在进行血液并行筛查时,合理地进行核酸检测和酶免检测,可以起到相辅相成的效果,从而确保血液并行筛查的安全。
简介:摘要目的研究并探讨核酸检测与酶联免疫检测血液病毒的临床效果。方法此次研究的对象是选取2013年7月—2016年7月该血站检验科血液样本500例,将其临床资料进行回顾性分析,并分别给予核酸检测与酶联免疫检测,并且计算与对比两种检测方法的阳性率。结果在HBV(乙型肝炎病毒)检测中,核酸检测阳性率为3.0%(15/500),同酶联免疫检测的1.2%(6/500)进行比较,差异有统计学意义(P<0.05);在HCV(丙型肝炎病毒)检测中,核酸检测阳性率为1.8%(9/500),同酶联免疫检测的1.6%(8/500)进行比较,差异无统计学意义(P>0.05);在HIV(人类免疫缺陷病毒)检测中,核酸检测阳性率为0.4%(2/500),同酶联免疫检测的1.8%(9/500)进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在血液病毒检测中,核酸检测与酶联免疫检测各具优势,存在一定的互补性,因此,可结合实际情况,给予两者联合应用,以此提高血液病毒检测准确性。
简介:摘要目的对比核酸检测与酶联免疫检测在血液病毒检测中的应用效果。方法将2018年1月—6月期间在我院进行献血的自愿者620例作为血液样本提供者,采集620例血液样本提供者的血液样本两份,一份为5ml,一份为7ml,分别将其放置在5ml和7ml的真空抗凝管中。其中5ml的血液样本在3h内给予血浆分离,然后进行核酸检测;其中7ml的血液样本在24h内给予血浆分离,然后进行酶联免疫检测。结果核酸检测法对血液中HBV检测的阳性率为2.74%,显著高于酶联免疫检测法的1.29%,比较差异具有统计学意义P<0.05。核酸检测法对血液中HCV检测的阳性率为1.77%,与酶联免疫检测法的1.61%相当,比较差异不具有统计学意义P>0.05。酶联免疫检测法对血液中HIV检测的阳性率为1.77%,显著高于核酸检测法的0.48%,比较差异具有统计学意义P<0.05。结论在实际的输血过程中,需重视核酸检测与酶联免疫检测的联合应用,才能够显著提高血液病毒的检测准确率,从而减少输血感染的发生,保证医疗用血安全。
简介:目的分析2014-2016年佛山地区无偿献血人群血液检测结果,为制定适合本地区科学、有效的献血招募和血液安全策略提供依据.方法利用酶联免疫法(enzymeimmunoassay,EIA)联合核酸检测技术(nucleicacidtechnology,NAT),对2014-2016年佛山地区无偿献血者的血液进行检测和分析.结果血液总不合格率逐年下降,年度不合格率比较,差异有统计学意义;总不合格率为3.74%,其中常规检测项目的不合格率由高到低依次为ALT(1.97%)、HBsAg(0.91%)、抗-TP(0.35%)、抗-HCV(0.34%)和抗-HIV(0.18%);NAT不合格率为0.25%,呈逐年减少的趋势,6人份混样的NAT试剂筛查效率明显高于24人份混样检测.结论佛山地区无偿献血人群中引起不合格的主要因素是ALT和HBsAg,梅毒、HCV等感染人群各占一定比例,抗-HIV阳性率呈逐年递增态势.采供血机构应在无偿献血人群中加强献血前健康检查与咨询,并选用更灵敏、特异的血液筛查技术,最大限度防止传染病经血传播,确保输血安全;同时血站应不断提高医务人员的业务素质,强化对无偿献血者的献血知识宣传教育,建立和发展低危、固定的无偿献血者队伍.
简介:摘要目的研究分析核酸检测与酶联免疫检测血液病毒的临床效果。方法此次研究的对象是选取2013年7月—2016年7月该血站检验科血液样本500例,将其临床资料进行回顾性分析,并分别给予核酸检测与酶联免疫检测,并且计算与对比两种检测方法的阳性率。结果在HBV(乙型肝炎病毒)检测中,核酸检测阳性率为3.0%(15/500),同酶联免疫检测的1.2%(6/500)进行比较,差异有统计学意义(P<0.05);在HCV(丙型肝炎病毒)检测中,核酸检测阳性率为1.8%(9/500),同酶联免疫检测的1.6%(8/500)进行比较,差异无统计学意义(P>0.05);在HIV(人类免疫缺陷病毒)检测中,核酸检测阳性率为0.4%(2/500),同酶联免疫检测的1.8%(9/500)进行比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在血液病毒检测中,核酸检测与酶联免疫检测各具优势,存在一定的互补性,因此,可结合实际情况,给予两者联合应用,以此提高血液病毒检测准确性。