简介:目的:研究人骨形态发生蛋白-2(bonemorphogeneticprotein,BMP-2)对人炎症牙髓组织来源的牙髓干细胞(dentalpulpstemcellsfrominflamedpulps,DPSCs-IPs)体外骨向诱导分化的影响。方法:取第三代DPSCs-IPs,按是否于培养基中加入BMP-2分成:BMP-2+DPSCs-IPs组(实验组)和DPSCs-IPs组(对照组)。无成骨诱导条件培养1周后,对各组分泌的胶原基质行Tri-chrome染色,观察并比较实验组和对照组之间的骨向诱导分化情况;实时定量RT-PCR检测二者的Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ,COL-Ⅰ)mRNA表达情况。在成骨诱导条件下,培养3周后对各组分泌的钙化基质行VonKossa染色,通过实时定量RT-PCR检测转录因子及成骨相关基因的表达。结果:无成骨诱导培养1周后,实验组DPSCs-IPs分泌的胶原基质Trichrome染色较对照组深,COL-ⅠmRNA的表达水平显著上调(P<0.05),说明BMP-2可诱导DPSCs-IPs沉积更多的胶原基质;成骨诱导培养3周后,相对于对照组,实验组DPSCs-IPs沉积了更多的钙化基质,Nanog、八聚体结合转录因子4(octamer-bindingtranscriptionfactor4,Oct4)、性别决定区因子(SRY-relatedhigh-mobilitygroupbox2,Sox2)等转录因子表达升高,碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨涎蛋白(bonesialoprotein,BSP),牙骨质蛋白1(cementumprotein1,CEMP-1)、COL-Ⅰ等成骨相关基因表达水平显著上调(P<0.05)。结论:BMP-2在成骨诱导条件下可促进DPSCs-IPs进行体外骨向诱导分化。
简介:目的:研究小鼠诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)向成骨细胞分化的能力,并观察Osterix对iPSCs成骨分化能力的影响。方法:利用体外细胞培养和病毒转染的方法,结合定量RT-PCR以及组织化学的方法检测在成骨诱导的条件下,iPSCs中成骨相关基因、蛋白的表达变化。结果:小鼠iPSCs经悬滴培养可以形成拟胚体,在成骨诱导条件下可以向成骨细胞分化。病毒转染并不影响iPSCs的多向分化潜能;与对照组相比,转染Osterix的iPSCs形成的矿化结节、碱性磷酸酶活性、成骨相关基因的表达均有明显增加(P〈0.05)。结论:在成骨诱导液培养条件下,小鼠iPSCs可以作为种子细胞向成骨细胞分化,并且过表达转录因子Osterix可以进一步促进iPSCs的成骨分化。
简介:目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞.利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF(50~1000ng/mL)作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型(NHE-1,NKCC-1)流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng/mL和100ng/mLEGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异(P〉0.05):500ng/mL和1000ng/mLEGF抑制细胞增殖。1000ng/mLEGF对细胞增殖的抑制作用更明显(P〈0.05)。表皮干细胞经过50ng/mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng/mlEGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。
简介:目的研究低氧对人牙周膜细胞(PDLC)的碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨相关基因表达的影响.方法采用组织块法体外分离培养人PDLC;取第3~5代细胞分别在常氧和低氧条件下培养后检测其ALP活性;并通过荧光定量聚合酶链反应(PCR)观察低氧处理后人PDLC中成骨相关基因的表达变化.结果低氧12、24、36、48h组ALP活性均比常氧组高;其中低氧48h组与常氧组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);低氧48h组ALPmRNA表达比常氧组高,差异具有统计学意义(P<0.05);4个时间点低氧组骨钙蛋白(OCN)mRNA表达均比常氧组高,且差异有统计学意义(12、36h:P<0.05;24、48h:P<0.01).结论低氧增强人PDLC的ALP活性,上调ALPmRNA和OCNmRNA的表达,促进人PDLC向成骨细胞分化,同时促进成骨细胞的矿化,提示低氧环境对人PDLC的骨向分化功能产生一定的影响.
简介:目的探讨软骨共培养体系诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化的可行性。方法GFP标记的小鼠ES细胞初步分化为EB后,将EB消化为单个细胞,同猪关节软骨细胞按一定比例(1:3)混合后接种于PGA材料,体外培养1周后植入裸鼠皮下3周取材。对照组为EB细胞接种组及软骨细胞接种组。取材后行连续冰冻切片,切片分别做荧光拍照,HE染色及甲苯胺蓝染色。结果组织学结果显示,EB细胞接种组形成畸胎瘤;软骨细胞对照组形成软骨组织;实验组形成软骨组织和畸胎瘤的混合体。甲苯胺蓝染色结果和荧光照片对照结果显示,部分软骨组织GFP阳性,由小鼠ES细胞分化而来。结论软骨其培养体系可以诱导小鼠ES细胞向软骨细胞分化,但得到的软骨组织不纯,混有畸胎瘤组织。
简介:目的分析毛囊区神经嵴干细胞(neuralcreststemcells,NCSCs)体外成骨分化能力及相关分子调控机制,探讨其用于骨再生修复的可行性。方法与成骨前体细胞MC3T3-E1比较分析,在DMEM/F12培养基中加入成骨诱导液,进行成骨分化诱导,通过免疫细胞化学、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)及茜素红染色,观察NCSCs成骨分化能力;在成骨诱导1、2、4、7周不同时段,RT-PCR方法分别检测Runx2、Osterix、转录活化因子4(activatingtranscriptionfactor4,Atf4)、骨桥素(os-teopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)等相关成骨分化调控基因的表达特点。结果免疫细胞化学检测显示,成骨特异性标记物Runx2、OPN、OCN均为阳性,但成骨分化能力低于MC3T3-E1细胞。RT-PCR结果发现,不同诱导时段,OPN、OCN及Atf4mRNA均表达,但Runx2早期高表达,晚期低表达,Osterix早、晚期表达,中期未见表达;而MC3T3-E1细胞在各期未见明显差异。NCSCs成骨诱导7周后,ALP和钙结节茜素红染色呈阳性。结论NCSCs具有成骨分化的能力,初步探讨其分化机制,为体内实验进行颌骨或颅骨缺损的修复奠定基础。
简介:摘要目的通过筛选能成功诱导人牙髓细胞(human dental pulp cell,HDPC)向成牙本质细胞样细胞分化的腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)的有效浓度,探讨体内诱导HDPC进行牙本质再生的ATP适宜浓度。方法用0(对照组)、10、400、600、800 μmol/L ATP处理HDPC后,采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)和蛋白质印迹法分别检测HDPC增殖以及成牙本质分化相关基因和蛋白[牙本质基质蛋白1(dentin matrix protein 1,DMP1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)]的表达;用茜素红染色评估诱导21 d后矿化结节情况(各组样本量均为5),并溶解矿化结节后定量分析各组溶液吸光度值(A值)。筛选既能有效诱导HDPC成牙本质向分化,又能降低ATP对HDPC增殖抑制作用的浓度作为ATP的适宜浓度,并选用此浓度进行动物体内实验。HDPC经此浓度ATP预处理7 d后接种于明胶海绵上,并置入6~7 mm长、管径1.0~2.5 mm的人牙根管片段内(ATP处理组,样本量为8);非ATP处理组的明胶海绵接种未经ATP预处理的HDPC(样本量为8),空白对照组的明胶海绵未接种细胞(样本量为2)。各组根管片段移植于免疫缺陷鼠(9只)背部双侧皮下,3个月后取材进行HE染色和组织学观察。结果培养5 d时与对照组相比,10 μmol/L ATP组HDPC增殖显著增加(P<0.05),而600和800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著减小(P<0.05),且800 μmol/L ATP组HDPC增殖显著小于600 μmol/L ATP组(P<0.05)。与对照组相比,600和800 μmol/L ATP组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均显著上调(P<0.05),且两组间差异无统计学意义(P>0.05),而其他各组DMP1、DSPP的基因和蛋白表达均无显著上调(P>0.05)。诱导21 d后600和800 μmol/L ATP组均可见明显的矿化结节,其他组均未见矿化结节;定量分析显示0、10、400、600、800 μmol/L ATP组A值分别为1.05±0.15、1.11±0.23、1.15±0.17、3.65±0.30、3.40±0.43,600与800 μmol/L ATP组A值均显著大于其他各组(P<0.05),且600与800 μmol/L ATP组间差异无统计学意义(P>0.05)。HE染色结果显示,600 μmol/L ATP可诱导HDPC在根管牙段内分化形成牙本质样结构。结论600 μmol/L为ATP诱导HDPC成牙本质向分化的适宜浓度,该浓度ATP可在免疫缺陷小鼠体内诱导HDPC形成牙本质样结构。
简介:目的建立人脂肪干细胞(ADSCs)来源的诱导干细胞(iPSCs)分化为尿路上皮细胞的模型。方法经活检获取患者脂肪,制备原代ADSCs,采用仙台病毒法建立ADSCs来源的人诱导干细胞系(hiPS),对hiPS细胞进行向尿路上皮细胞的诱导分化,并使用免疫组化和流式细胞仪检测分化效果。结果脂肪干细胞高表达CD44,低表达CD45和CD105,使用仙台病毒法过表达脂肪干细胞OCT3/4,SOX2,KLF4和c-MYC的转录水平建立非整合的hiPS细胞系,证明其表达多能性标志,具有三胚层多向分化的能力。在相关因子和尿路上皮细胞专用培养基的处理下,诱导21d的hiPS细胞已出现上皮样结构,其表达尿路上皮细胞特异标志UP1a达到70%以上,免疫组化见分化后的细胞大量表达尿路上皮细胞特异标志UP1a,UP1b和UP2。结论ADSCs源性iPSCs具备向尿路上皮分化的能力,该细胞系的建立有望为尿道缺损患者开展个体化的尿道修补治疗提供优质的种子细胞。
简介:摘要目的探讨并分析淫羊藿苷对人牙周膜细胞增殖及骨向分化的影响。方法体外进行人牙周膜细胞的培养,基于矿化诱导这一条件下,把第三代细胞和六个不同浓度淫羊藿苷进行互相作用,即浓度为零(对照组)、浓度为10mg/L、1mg/L、0.1mg/L、0.01mg/L、0.001mg/L,借助于BSP表达水平、噻唑蓝比色法以及ALP活性测定,就其对于人牙周膜细胞增殖与骨向分化的影响进行分析。结果作用24个小时后,不同药物浓度都可使人牙周膜细胞增殖;48小时后,淫羊藿苷在1-0.001mg/L区间,对于人牙周膜细胞增殖能力的强化较为显著,在10mg/L时影响较小;72个小时后,淫羊藿苷浓度在0.1-0.001mg/L区间时,增殖能力较为显著;作用72个小时后,浓度在1-0.001mg/L区间的组数推动人牙周膜细胞骨向分化,相对于对照组而言,所存差异具有统计学意义,即P<0.05,而10mg/L组和对照组之间所存差异不具统计学意义,即P>0.05。结论基于一定的浓度范围内,利用淫羊藿苷不仅可以推动人牙周膜细胞的增殖,同时还可进一步推动其骨向分化。
简介:背景:人脐带间充质干细胞较骨髓、脂肪等来源的间充质干细胞易取材、更为原始,并不受伦理、法律的限制,是中枢神经系统损伤修复最具治疗潜力的细胞来源之一。目的:探讨重组人碱性成纤维生长因子、重组人表皮生长因子定向诱导人脐带间充质干细胞分化为神经干细胞的潜能。方法:采用碱性成纤维生长因子、表皮生长因子作为诱导剂,体外诱导人脐带间充质干细胞;在倒置显微镜下动态观察细胞形态学变化,并用免疫荧光法检测人脐带间充质干细胞向神经干细胞分化的情况,实时荧光定量PCR技术检测诱导前后神经干细胞标记蛋白巢蛋白在mRNA水平的相对表达量。结果与结论:形态学观察经诱导后的人脐带间充质干细胞呈神经干细胞球改变;免疫荧光法及实时荧光定量PCR技术均可检测到神经干细胞标记物巢蛋白,并可进一步分化表达神经元标志蛋白神经元特异性烯醇化酶、微管相关蛋白2以及神经胶质细胞蛋白、神经胶质原纤维酸性蛋白。碱性成纤维生长因子、表皮生长因子可定向诱导人脐带间充质干细胞向神经干细胞及神经元、神经胶质细胞分化。
简介:目的通过改良差速贴壁法分离纯化绵羊MDSC,探索转化生长因子(TGF-β1)诱导绵羊肌源性干细胞分化为平滑肌的可能性。方法取成年绵羊股四头肌细胞采用改良差速贴壁法(modifiedpreplatetechnique)进行优化、分离、纯化获得绵羊级源性干细胞(MDSC)。利用流式细胞仪鉴定CD44、CD34、CD31、CD45、CD14的表达;westernbloting法检测干细胞标志物desmin表达情况鉴定MDSC。然后利用10ng/mlTGF-β1诱导MDSC向平滑肌方向分化;随后利用Westernbloting法检测诱导培养基处理的MDSC中平滑肌蛋白标志物a-SMA和calponin的表达;结果通过对改良差速贴壁法成功分离出成年绵羊的肌源性干细胞(MDSC)。流式细胞仪鉴定其干细胞标志物CD44、CD34阳性表达,同时CD31、CD45、CD14表达阴性。Westernblotting检测MDSC中Desmin呈阳性表达。利用10ng/mlTGF-β1成功诱导MDSC向平滑肌方向分化。诱导过程中,平滑肌特异蛋白a-SMA和calponin在诱导细胞中的表达逐步上升。结论本研究通过对差速贴壁法成功分离出成年雌性绵羊的肌源性干细胞(MDSC)。并首次利用TGF-β1诱导羊肌源性干细胞(MDSC)成功向平滑肌方向分化。