简介:幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,Hp)是上消化道疾病的主要致病菌,它的感染不但与B型胃炎和消化性溃疡的发生有密切关系,而且与非溃疡性消化不良,MALT淋巴瘤和胃癌也有重要关系,并已被世界卫生组织列为胃癌等肿瘤的相关致病菌[1,2,3].Hp在我国普通人群的感染率较为高50%~80%[4].随着分子生物学技术的发展,幽门螺杆菌致病机理研究的进一步深入,有效抗原的筛选,以及基因工程菌株构建的运用,将预防和根治Hp的感染成为了可能.因此,本实验以Hp特快特异性基因--18kDa外膜蛋白基因,经PCR扩增,构建重组载体,为在原核生物表达创造条件,同时为疫苗的研究以及快速诊断试剂盒的开发奠定基础.
简介:目的了解在广东省受血及献血者中发现的HIV-1亚型的流行规律及其与国际参考株的同源性.方法应用套式聚合酶链反应(PCR)对14例采自于广东省HIV-1抗体阳性的受血者或献血者淋巴细胞富集液的核酸样品进行扩增,并使用AB1377型测序仪对扩增产物测序后,对其ENV基因C2-V3段的核酸序列进行比较分析.结果14份血样中,7份为泰国B'亚型,与国际参考株RL42的距离最近,基因离散率为(6.082±2.607)%,组内离散率为(5.963±2.383)%;4份为AE重组亚型,与国际参考株TH.90.CM240最近,基因离散率为(8.900±1.830)%,组内离散率为(13.810±1.317)%;2份为07-BC重组亚型,与国际参考株CN.97C54A最近,基因离散率为(4.155±1.223)%,组内基因距离为6.36%;1份为08-BC重组亚型,与国际参考株97CNGX-9F最近,基因距离为0.97%.结论本次检测的广东省受血及献血者HIV-1以泰国B'亚型为主,也存在主要在性途径感染人群中流行的AE重组亚型和吸毒者中流行的07-BC、08-BC重组亚型.
简介:摘要目的观察布鲁菌外膜蛋白(OMP)16脂化型(L16)和非脂化型(U16)对成骨细胞的毒力效应。方法利用大肠埃希菌BL21(DE3)原核表达系统制备L16和U16重组蛋白,并使用镍柱纯化。采用成组设计,利用小鼠成骨细胞系(MC3T3细胞)分别与L16和U16重组蛋白共孵育(L16、U16刺激组),以布鲁菌脂多糖(LPS)刺激物为阳性对照(LPS对照组),未加任何刺激的细胞作为阴性对照,孵育时间为24 h。CCK-8法检测MC3T3细胞的活力;离心收集培养细胞上清,生物发光法测定上清中乳酸脱氢酶(LDH)的释放率,评价L16和U16对MC3T3细胞的毒力作用;进一步使用Annexin Ⅴ-PE/7-AAD双染流式细胞术检测MC3T3细胞的凋亡率,以及通过免疫印迹法(WB)检测凋亡执行蛋白Caspase-3的活化水平。结果L16刺激组细胞活力[(56.16±1.63)%]显著低于U16刺激组和LPS对照组[(97.02±1.44)%、(98.64±0.90)%,P均< 0.01],LDH释放率[(84.64±0.96)%]显著高于U16刺激组和LPS对照组[(34.82±3.41)%、(26.75±1.95)%,P均< 0.01]。Annexin Ⅴ-PE/7-AAD染色结果显示,L16刺激组细胞凋亡率为(46.45±2.19)%,而其余组均< 1%。WB结果显示,L16刺激组细胞内存在活化的Caspase-3,而U16刺激组和LPS对照组未检测到此活化片段。结论L16能诱导成骨细胞的凋亡,使成骨细胞的增殖受到抑制,而U16的作用不明显,具备完整脂化结构的布鲁菌L16是毒力效应所必需的。
简介:目的:应用蛋白质组学技术研究幽门螺杆菌(HP)的候选抗原,用于胃部疾病临床诊断、治疗和疫苗开发.方法:选择自胃腺癌患者胃粘膜分离出且经确定的HP菌株(HP161),采用二维凝胶电泳(2-DE)分析外膜蛋白,并通过PDQuest图像分析软件分析蛋白质图谱,进行蛋白斑点检测和分析;收集20例HP感染患者和10例非HP感染相关性胃炎患者血清,采用免疫印迹技术分析HP161的外膜蛋白质与上述血清的反应性.结果:HP161有129个蛋白斑点;被慢性活动性胃炎和胃癌患者血清不同识别的特定抗原有10个;应用胃癌患者血清时,具有免疫反应性,而用胃炎患者血清时则无,等电点范围较宽,分子量多数在31kDa以下.结论:2-DE是研究HP外膜蛋白质组学的重要途径之一,并可能对其进行鉴定作为临床诊断的候选分子;经免疫蛋白组学检测的资料与公共数据库进行对比分析,以有助于寻找更具免疫原性的蛋白质标记物用于诊断分析和疫苗设计.
简介:目的评价嗜肺巴氏杆菌外膜蛋白(OMP)和脂多糖(LPs)作为血清学诊断抗原的敏感性和特异性.方法用OMP、LPS和全菌(WC)作为Westernblot和ELISA的诊断抗原检测自然感染和实验感染嗜肺巴氏杆菌小鼠相应的IgG抗体滴度,同时测定3种抗原与实验动物常见致病菌的交叉反应.结果与嗜肺巴氏杆菌自然感染和实验感染小鼠血清的ELISA反应中,不同时期,LPS作为诊断抗原时血清抗体阳性率最高,WC次之,OMP最低.自然感染小鼠群中,出生4周LPS抗体阳性率即可达80%,而同期的WC和OMP仅为25%和20%,故LPS敏感性最高.与实验动物常见致病菌免疫血清和阴性种鼠血清的ELISA反应中,WC抗原表现出较高的吸光度(A)值,经Westernblot证实,其反应为非特异性反应,LPS抗原特异性最强,OMP抗原次之.结论混合多株具有型或种特异性的OMP或LPS作为ELISA的诊断抗原,无论从特异性和敏感性上均高于全菌抗原.
简介:以氨基酸组成为特征对膜蛋白的分类,忽略了序列残基之间的相关性信息,而采用传统支持向量机算法作为分类算法,在解决多类问题时会出现分类盲区问题。针对这两种情况,计算蛋白质序列的氨基酸组成、二肽组成以及6种氨基酸相关系数,将三类特征结合,作为膜蛋白序列的特征向量;同时采用模糊支持向量机作为分类器,解决了传统支持向量机在多类数据识别中的盲区问题。测试结果表明,在相同特征输入下,模糊支持向量机分类性能优于传统支持向量机;在相同分类器的情况下,氨基酸组成、二肽组成和相关系数组合的特征选择方法的分类性能优于只使用其中一类或两类特征的方法;而采取组合特征和模糊支持向量机相结合的分类策略,在独立性数据集测试中的整体预测精度达到97%,优于现有的多种分类策略,是目前最有效的膜蛋白分类方法之一。
简介:摘要目的克隆并表达中国莱姆病螺旋体基因型代表菌株伽氏疏螺旋体(Borrelia garinii,B.garinii)PD91外膜蛋白A(OspA)的126~274 aa肽段,并对其免疫保护性进行初步研究。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增B.garinii PD91的126~274 aa OspA肽段基因,克隆至原核表达载体pET-30a上,构建pET-30a-OspA-pep重组质粒,转入大肠埃希菌感受态细胞BL21(DE3)中,利用IPTG诱导表达,表达产物用Ni-IDA树脂层析纯化,采用Western blot分析其免疫原性。将不同剂量的重组OspA-pep(rOspA-pep)蛋白(20、30、40、50、60、80、100 μg)免疫新西兰家兔,采用间接免疫荧光法(IFA)检测免疫前后的抗体滴度,选取产生抗体滴度最高的剂量组为最佳剂量组。用最佳剂量组的免疫兔血清进行体外中和试验以检测rOspA-pep蛋白免疫后血清抗体的体外杀菌能力,同时用最佳剂量的rOspA-pep蛋白免疫新西兰家兔,观察其抗体滴度变化。结果重组质粒pET-30a-OspA-pep构建成功并在宿主菌体内高效表达。Western blot表明rOspA-pep蛋白与B.garinii PD91的多抗有明显的免疫应答。IFA检测结果表明rOspA-pep蛋白免疫后的兔血清IgG抗体滴度明显升高(最高可达1∶2 480),40 μg为rOspA-pep的最佳免疫剂量。体外中和试验结果表明该剂量rOspA-pep蛋白免疫家兔后产生的抗体对106个/ml的B.garinii和阿弗西尼疏螺旋体(Borrelia afzelii,B.afzelii)型代表菌株PD91和FP1的中和率达100%,对107个/ml的FP1的中和率为100%,对107个/ml的PD91的中和率为60%。用40 μg rOspA-pep在1 d和30 d免疫新西兰家兔2次后,其抗体达到高峰,持续时间为3~4个月,之后抗体滴度逐渐下降。结论中国莱姆病螺旋体基因型代表菌株B.garinii PD91的126~274 aa OspA肽段具有较好的免疫原性,其诱导的抗体有较好的体外中和能力,可作为中国二代亚单位疫苗的候选成分。
简介:目的:研究重度室息新生儿及新生儿铗氧铗血性脑病(HIE)血小板a-颗粒膜蛋白(GMP-140)浓度的变化。方法:采用酶联免疫法测定42例重度窒息足月新生儿和20制正常足月新生儿血小板a-颗粒膜蛋白(GMP-140)难度。结果;室息组生后第一天GMF-140浓度为42.7±17.4ng/ml,明显高于对照组,差异有非常显著意义(P<0.001)。发生中重度HIE的GMP-140浓度与无益生HIE者比较.差异有非常显著意义。结论:GMP-140浓度可间接反映血小板活化的情况。血小板活化因子在新生儿HIE中起着重要的病理生理作用。GMP-140维度与HIE关系密切。