简介:摘要目的探索即时、快速、准确的新型冠状病毒(2019-nCoV)抗原检测方法,提高新型冠状病毒感染者检出率,并建立2019-nCoV的S蛋白特异性检测方法。方法本研究利用ELISA方法对前期研发的2019-nCoV基因工程单克隆抗体(mAb)进行配对检测,从中挑选出最优检测抗体组合,建立了新型冠状病毒抗原检测双抗体夹心ELISA方法,并对检测方法进行条件优化。结果本实验室前期筛选出的12株2019-nCoV基因工程单克隆抗体对2019-nCoV S蛋白具有良好的结合活性,是抗原检测候选抗体。本研究所建立的新型冠状病毒抗原检测双抗体夹心ELISA方法可快速有效的检测2019-nCoV S蛋白,灵敏度较高,对S蛋白检出限小于1 ng/ml。结论本研究所建立的抗原检测方法可特异性检测2019-nCoV的S蛋白,为COVID-19感染的早期、敏感、特异诊断提供了有意义的参考。
简介:摘要目的建立并验证测定14型肺炎球菌多糖(pneumococcal capsular polysaccharide serotype 14,PS14)浓度的双抗体夹心ELISA。方法采用Protein G亲和层析纯化兔血清,得到兔抗PS14多克隆抗体(多抗)。以鼠抗PS14单克隆抗体(单抗)为捕获抗体,兔抗PS14多抗为检测抗体,碱性磷酸酶标记山羊抗兔IgG为二抗,PS14为参考品建立双抗体夹心ELISA。确定鼠抗PS14单抗和兔抗PS14多抗的工作浓度,建立标准曲线,并验证该方法的准确性、精密度和特异性,考察佐剂对该方法的影响。结果鼠抗PS14单抗的最适工作浓度为5 μg/ml,兔抗PS14多抗的最适工作浓度为1 μg/ml,标准曲线的范围为9.375 ~ 600.000 ng/ml,线性良好,相关系数为0.999。测定多糖样品的PS14回收率为110% ~ 140%,多糖蛋白结合物样品的PS14回收率为90% ~110%。平均批内和批间精密度分别是5.64%和7.14%。13价结合物混合样品的PS14回收率为85%~100%;含有佐剂的疫苗样品的PS14回收率为85% ~110%。结论成功建立了双抗体夹心ELISA,该方法准确性、精密度、特异性良好,且检测结果不受佐剂的影响,具有一定耐用性。
简介:摘要目的建立汉城病毒(Seoul virus, SEOV)L99株特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法,验证其检测性能,为双价肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS)疫苗研制、生产和检定过程中Ⅱ型病毒抗原含量检测提供有效手段。方法小鼠体内诱生法制备L99病毒单克隆抗体(monoclonal antibody, McAb)腹水,Protein-A亲和层析纯化腹水抗体,SDS-PAGE鉴定纯化抗体纯度,间接ELISA法测定McAb效价,Western blot鉴定其特异性;叠加ELISA法对4株McAb进行抗体配对。用辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记单抗后,通过正交试验优化包被和标记抗体使用浓度,建立双抗体夹心ELISA病毒抗原检测方法。以Ⅱ型HFRS疫苗标准品作为定量标准,验证方法的检测限、线性范围、专属性、准确性、精密度;通过检测3批Ⅱ型病毒疫苗灭活原液验证方法适用性。结果4株McAb腹水效价均>1∶106,抗体纯度均>98%;经Western blot鉴定,1D5、3A4、5B7特异识别Ⅱ型L99株出血热病毒核衣壳蛋白,2E3与Ⅰ型PS-6株出血热病毒存在交叉反应;经抗体配对筛选后,选择3A4为包被抗体,1D5为标记抗体;棋盘滴定法确定包被抗体工作浓度为20 μg/ml,HRP标记抗体工作浓度为1∶4 000。该方法对SEOV L99抗原最低检测限为0.078 1 μg/ml;线性范围为0.078 1~2.500 0 μg/ml,R2>0.99;专属性验证其对Ⅱ型HFRS疫苗具有检测特异性;抗原回收率在95.8%~108.7%之间,精密度验证变异系数<10%。用该方法检测3批Ⅱ型HFRS灭活疫苗原液结果均呈剂量依赖性。结论成功建立了SEOV L99株型特异性双抗体夹心ELISA抗原检测方法,为地鼠肾双价肾综合征出血热疫苗生产及检定过程中,SEOV L99株病毒抗原含量测定提供了检测方法。
简介:摘要目的获得纯化的GTV-rNP蛋白抗原,并建立快速准确检测GTV抗体的ELISA法。方法人工合成密码子优化的 GTV-NP 编码基因,克隆至 pET32a(+)载体,构建重组表达质粒,转化至 BL21(DE3)。将优化表达获得的蛋白经Ni柱纯化后用SDS-PAGE和Western blot鉴定。以纯化蛋白为抗原,建立并优化GTV IgG抗体间接ELISA检测方法,并对其进行评价和初步应用。结果成功构建原核表达质粒pET32a-NP,重组蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中高效表达,大小约为44 kD,Western blot结果表明重组蛋白与GTV阳性血清具有良好的抗原性。建立的ELISA法特异性强、敏感性高、批内和批间的变异系数均小于10%具有较好的重复性;检测结果与IFA检测结果符合率达到92.77%。结论建立的GTV NP 抗体检测ELISA方法的敏感性、重复性和特异性均较好。
简介:摘要目的以原核系统表达的麻疹病毒核蛋白作为包被抗原,初步建立检测麻疹病毒抗体的间接ELISA方法,并将其应用于人群抗体水平的评估。方法对各项实验条件进行筛选和优化,确定间接ELISA法的操作流程,并检测了157份健康儿童和新生儿母亲血清中的抗麻疹病毒IgG抗体,与商品化麻疹病毒ELISA IgG抗体检测试剂盒进行比较。结果本研究建立的间接ELISA方法批内和批间的重复性试验变异系数均小于10%,与试剂盒检测结果相比,血清标本的总符合率为95.5%,灵敏度和特异度分别可达94.8%和98.3%。其中,两种方法检测的85份0~15岁健康儿童血清麻疹病毒IgG抗体阳性率,无论是<8月龄组或8月龄~15岁组,结果差异均无统计学意义(χ2=0.313,P>0.05;χ2=0.000,P>0.05),且通过本研究所建立的ELISA方法检测的麻疹病毒抗体水平表现出与试剂盒检测结果在不同年龄组一致的增减趋势,两种方法定量结果的相关系数r为0.893(P<0.001),显示出该方法具备的定量潜力。结论本研究建立的ELISA方法具有良好的稳定性,且灵敏度高、特异度强,与商品化试剂盒检测结果无明显差异,可用于麻疹病毒血清流行病学调查和疫苗免疫后人群抗体水平的评估。
简介:摘要目的初步建立抗新型冠状病毒受体结合域(receptor-binding domain, RBD)IgG定量ELISA检测方法,用于COVID-19静注人免疫球蛋白生产中原料血浆、原液和成品的效价检测。方法将已知的具有中和活性的COVID-19康复者恢复期血浆作为参比标准品,选用RBD抗原包被的间接ELISA试剂盒,采用双对数拟合曲线建立定量ELISA,确定其最佳线性范围;制备室内质控品,并对其进行标定;对该方法进行稀释线性、平行性、准确度、精密度验证。用建立的方法对3批COVID-19静注人免疫球蛋白的原料血浆、原液及成品进行检测,并与化学发光法及中和实验结果进行相关性分析。结果确定标准曲线线性范围为稀释倍数1~8、批内准确度88.50%~108.58%,批间准确度100.63%~103.98%;批内精密度3.83%~14.68%,批间精密度5.67%~13.15%;标准品和原料血浆、原液、半成品的平行性好。ELISA效价与化学发光法及中和实验相关性较好。结论成功建立抗新型冠状病毒RBD IgG定量ELISA检测方法,可用于COVID-19静注人免疫球蛋白的效价检测,作为内部放行方法。
简介:摘要目的制备抗柯萨奇病毒A组2型(coxsackievirus A2,CV-A2)单克隆抗体(单抗),建立CV-A2抗原检测方法。方法用纯化后的CV-A2全病毒颗粒免疫小鼠,筛选获得抗CV-A2单抗。建立CV-A2抗原检测方法,确定线性范围,对其准确度、精密度、稳定性、专属性进行验证。用ELISA检测病毒颗粒纯化过程中样品的抗原含量。结果制备了高效价的抗CV-A2单抗并建立ELISA抗原检测方法,检测范围为5.00~320.00 ng/ml。高、中、低3个浓度样品准确度验证回收率在89.58%~104.78%之间。重复性验证变异系数分别为2.10%、2.47%、6.18%。中间精密度验证变异系数分别为2.89%、2.69%、1.94%。耐用性验证回收率在84.26%~114.21%之间。包被微孔板于37 ℃放置3 d,样品回收率在90.31%~103.11%之间。专属性验证结果显示该方法只识别CV-A2抗原,与其他抗原均无交叉反应。结论建立并验证了CV-A2 ELISA抗原检测方法,可应用于病毒纯化过程中样品的抗原检测,还可应用于含CV-A2的手足口病多价疫苗的CV-A2抗原含量检测。
简介:摘要目的探讨ELISA检测乙型脑炎减毒活疫苗中庆大霉素残留量的数据拟合模型,以验证和优化定量检测系统。方法采用商品化庆大霉素残留酶联免疫检测试剂盒对乙型脑炎减毒活疫苗进行庆大霉素残留量检测,通过二次多项式模型、对数线性模型和四参数logistic模型对实验数据进行拟合处理,分析比较各模型的决定系数(R2)、实验点分布、回收率等指标。结果二次多项式模型、对数线性模型和四参数logistic模型的变量显著性检验均有统计学意义(P<0.05),R2均值分别为0.997 0、0.994 4、0.999 3,二次多项式模型和四参数logistic模型拟合优度较好;各拟合模型的标准品实验点在标准曲线两侧的分布都较为均匀,四参数logistic模型最佳,尤其是在中、低浓度范围(0.1~0.9 ng/ml);各拟合模型在0.1~8.1 ng/ml浓度范围的标准品回收率均达到中国药典要求,且差异无统计学意义。结论二次多项式模型、对数线性模型和四参数logistic模型均适用于ELISA检测庆大霉素残留量的数据分析,其中二次多项式模型和四参数logistic模型拟合较好,这对持续优化该项定量检测具有重要指导意义。
简介:摘要目的建立检测唾液酸化胎球蛋白A(Sia-fetuin A)的凝集素-酶联免疫吸附试验方法(lectin-ELISA),探讨其在原发性肝细胞癌(HCC)中的诊断价值。方法收集2017至2020年于上海东方肝胆外科医院就诊的HCC患者300例,疾病对照160例(包括肝硬化亚组36例、慢性乙型肝炎亚组124例),另同期收集健康体检者100名作为健康对照。根据接骨木凝集素(SNA)可与糖链末端α-2,6-半乳糖的唾液酸结合原理构建lectin-ELISA方法,检测各组血清Sia-fetuin A水平,以450 nm处吸光度值表示。采用logistic回归方法建立多指标联合检测模型,采用受试者工作特征曲线(ROC)评估单项指标及联合检测模型诊断HCC效能。结果建立了检测血清Sia-fetuin A的lectin-ELISA实验方法,其线性回归系数为0.978 5,精密度评估及干扰实验均符合临床检测要求。采用该方法检测各组血清Sia-fetuin A水平,HCC组、疾病对照组和健康对照组分别为1.362±0.310、1.199±0.370、1.086±0.420,3组之间依次降低。Sia-fetuin A、AFP和二者联合检测模型鉴别诊断HCC的曲线下面积分别为0.790、0.809和0.860,诊断模型敏感度79.3%(238/300),特异度95.0%(247/260)。HCC组300例患者中138例(46%)患者血清AFP为阴性(<20 μg/L),其血清Sia-fetuin A水平为1.364±0.305。将疾病对照组与健康对照组合并为非患癌组,其血清Sia-fetuin A水平为1.146±0.381。AFP阴性HCC患者血清Sia-fetuin A水平高于非患癌患者(t=6.134,P<0.001)。Sia-fetuin A与联合诊断模型诊断AFP阴性HCC的曲线下面积分别为0.776、0.919,联合诊断模型敏感度93.4%(129/138),特异度77.3%(201/260)。结论血清Sia-fetuin A及其联合检测模型可为AFP阴性HCC患者提供新的辅助诊断指标。
简介:摘要目的探讨酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)联合明胶颗粒凝集试验(Treponema Pallidum Particle Agglutination assay,TPPA)对梅毒的检测价值。方法选择2018年1月至2019年1月本院收治的疑似梅毒患者70例,均采用ELISA及TPPA对患者血清样本进行检测,以淋巴结穿刺液查见梅毒螺旋体作为金标准。比较两种检测方法单独使用及联合使用的诊断结果(诊断准确度、特异度、灵敏度、阳性预测值及阴性预测值)。结果经淋巴结穿刺检查,70例疑似梅毒患者中有50例梅毒患者;经ELISA单项检测,70例疑似梅毒患者中有47例梅毒患者;经TPPA单项检测,70例疑似梅毒患者中有47例梅毒患者;经ELISA及TPPA联合检测,70例疑似梅毒患者中有49例梅毒患者;ELISA与TPPA联合检测准确度、灵敏度、特异度及阴性预测值分别高于ELISA单项检测及TPPA单项检测,差异均有统计学意义(均P<0.005);ELISA与TPPA联合检测阳性预测值高于ELISA单项检测结果,差异有统计学意义(χ2=4.696,P=0.012)。结论ELISA与TPPA联合检测在梅毒诊断中具有较高应用价值,可提高准确度、灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值,值得临床进一步推广应用。
简介:AbstractAfrican swine fever (ASF) is a highly infectious, transboundary viral disease of domestic and wild pigs, and is currently the most serious threat to world swine production, resulting in significant economic loss. In the absence of vaccines and treatments, the control of the disease entirely depends on accurate and early diagnosis accompanied by the culling of infected pigs. Thus, a highly specific and sensitive diagnostic assay is required during an outbreak and surveillance of the disease. In this study, a highly sensitive, specific, rapid and repeatable P22-monoclonal antibody-based blocking enzyme-linked immunosorbent assay (bELISA) assay was developed for the detection of antibodies against genotype I and II African swine fever viruses(ASFVs). A total of 806 pig serum samples were tested to evaluate the performance of the diagnostic assay. To determine the PI (percent Inhibition) cut-off value, receiver-operating characteristic (ROC) analysis was applied. According to the ROC analysis of the data, 98.10% specificity and 100% sensitivity were recorded when the threshold cut-off value of PI was established at 47%. In addition, the assay was able to detect ASFV antibodies as early as 9 days post-infection when serum samples from experimentally infected pigs were used. Taking all together, the results of the present study indicated that the P22-mAb based bELISA assay can be used for rapid and accurate detection of antibodies against ASFV, which could play a valuable role in the containment and prevention of ASFV as an alternative to other serological diagnostic methods. Also, this study will assist researchers to further investigate the immunogenic importance of P22 protein in ASFV infection.
简介:无
简介:摘要空域安全评估是确保空域方案安全合理、运行顺畅的有效手段。遵循科学、合理、可操作性的方法和程序开展空域安全评估。可以全而、有效地发现空域方案存在的问题和风险.以便采取措施消除、规避风险。将风险发生概率、产生的结果控制在可接受范围内。确保空域方案安全性,实现安全关口前移。作为有效的评估方法之一的因果模型,有事件树分析法、故障树分析法、蝶形分析法、事故风险分析四种。在空域划设后,验收安全评估阶段,因果模型可以简洁快速的对空域进行安全评估。