简介:以pBRTM/HCV-3011模板,通过PCR法扩增ns5a、LISDR(左端序列)和RISDR(右端序列),分别经XhoⅠ/EcoRⅠ、XhoⅠ/HindⅢ和EcoRⅠ/HindⅢ双酶切,连入穿梭质粒pEGFP-N3中,构建重组质粒pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-△ISDR.对重组质粒进行酶切分析和序列测定.将这2种重组质粒通过电穿孔法转染HeLa细胞,然后在G418选择压力下进行有限稀释法筛选,用RT-PCR和荧光显微镜鉴定.经酶切鉴定和基因测序证实,重组穿梭质粒已插入目的片段ns5a、LISDR和RISDR.RT-PCR和荧光显微镜检测到目的基因的表达.以上结果说明成功构建了真核表达载体pEGFP-N3-ns5a和pEGFP-N3-ns5a-△ISDR,目的基因在HeLa细胞中得到表达,为研究HCVNS5A中是否存在抗干扰素治疗的功能蛋白提供了实验材料.
简介:目的:采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法:设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果:巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论:建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。
简介:应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×105个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于107tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于1010tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly4Ser)315个氨基酸连接肽。
简介:目的:本实验室通过转座突变技术获得了一株高产表面活性物质的芽孢杆菌dhs-330-021,研究其对链状亚历山大藻的抑制效果,及其溶藻作用方式。方法:在链状亚历山大藻的培养液中添加dhs-330-021的发酵液等,间隔一定时间计数获得藻细胞的数量。结果:菌株dhs-330—021培养后期的发酵液溶藻效果好于培养前期和中期;在一定浓度范围内,dhs-330-021的发酵液对不同生长期的链状亚历山大藻均有溶藻效果,其中对延滞期和稳定期效果最好;菌株的发酵液和无菌上清液的溶藻效果明显,而菌悬液溶藻效果较差。结论:菌株dhs-330-021能显著抑制链状亚历山大藻的生长,其溶藻方式属于间接溶藻。
简介:目的:研究柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌SIPI-1482中酮还原酶基因dnrU阻断后的产物(13s)-13-二氢柔红霉素及其他发酵产物的变化。方法:利用同源重组的原理,以大肠杆菌质粒pUC18为基础构建了dnrU基因交换质粒,通过在SIPI-1482染色体上的dnrU基因中插入安普霉素抗性基因来筛选dnrU的阻断突变株。结果和结论:PCR验证表明成功地阻断了dnrU基因。dnrU基因敲除后,重组菌发酵产物中(13s)-13-二氢柔红霉素消失,而其他发酵中间产物也有一定变化。
简介:目的:建立一种灵敏、特异、快速的ELISA方法,用于猕猴血清中抗死亡受体5(DR5)单克隆抗体的检测。方法:采用双抗夹心ELlSA法,用猴血清吸附的羊抗入IgG包被于96孔酶标板,加入待测样品,用HRP标记的猴血清吸附的羊抗人IgG进行检测,加底物显色,读取D450值。结果:建立了检测抗DR5单克隆抗体的ELISA方法并进行了确证,方法的线性范围为12.5-800ng/mL,定量下限为12.5ng/mL,板内和板间精密度均小于15%,准确度为-4-15%,冻融稳定性和稀释稳定性良好。结论:方法学确证结果表明,本研究建立的抗DR5单克隆抗体检测方法符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则要求,可用于抗DR5单克隆抗体的检测。
简介:目的:探究胃炎康方5号联合西医治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效。方法:选取在我院接受治疗的慢性萎缩性胃炎患者94例,分为对照组和实验组,对照组患者采用常规的胃三联治疗方法,实验组患者在对照组患者的治疗方法之上再加上胃炎康方5号治疗,观察分析和对比两组患者的治疗效果以及Hp根除率(幽门螺旋杆菌根除率)。结果:对照组患者治疗的总有效率为46.81%,Hp根除率为82.98%,实验组患者治疗的总有效率为80.85%,根除率为93.62%,两组结果相比较,差异显著,有统计学意义(P<0.05)。结论:胃炎康方5号联合西药治疗慢性萎缩性胃炎的临床疗效显著,值得临床推广。