简介：摘要目的探讨P311对人微血管内皮细胞1（HMEC-1）血管形成能力的影响及其可能的分子机制。方法采用实验研究方法。取HMEC-1，按随机数字表法（分组方法下同）分为P311腺病毒组和空载腺病毒组，分别进行48 h相应转染后，采用细胞计数试剂盒8法检测培养1、3、5 d细胞增殖活性；划痕试验检测细胞划痕后6、11 h剩余划痕面积，并计算剩余划痕面积百分比；体外血管形成实验观察细胞培养8 h血管形成情况，并测量管状结构节点数和总长度；蛋白质印迹法检测细胞中血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、磷酸化VEGFR2、胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）及磷酸化ERK1/2蛋白表达量。取HMEC-1，分为P311腺病毒+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组、空载腺病毒+阴性对照siRNA组、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组和空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组，分别进行相应的处理，蛋白质印迹法检测转染24 h细胞中VEGFR2、磷酸化VEGFR2、ERK1/2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量；体外血管形成实验观察转染24 h细胞血管形成情况，并测量管状结构节点数和总长度。取HMEC-1，分为P311腺病毒+二甲基亚砜（DMSO）组、空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组和空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组，分别进行相应的处理。蛋白质印迹法检测处理2 h细胞中ERK1/2及磷酸化ERK1/2蛋白表达量；体外血管形成实验观察处理2 h细胞血管形成情况，并测量管状结构节点数和总长度。各组各时间点样本数均为6。对数据行独立样本t检验、重复测量方差分析、单因素方差分析、LSD检验。结果与空载腺病毒组比较，P311腺病毒组细胞培养1、3、5 d增殖活性均没有明显改变（t值分别为-0.23、-1.30、-1.52，P>0.05）。P311腺病毒组细胞划痕后6、11 h剩余划痕面积百分比均较空载腺病毒组明显降低（t值分别为-2.47、-2.62，P<0.05）。培养8 h，与空载腺病毒组比较，P311腺病毒组细胞管状结构节点数和总长度均明显增加（t值分别为4.49、4.78，P<0.01）。转染48 h，与空载腺病毒组比较，P311腺病毒组细胞VEGFR2、ERK1/2蛋白表达量均无明显变化（P>0.05），磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显升高（t值分别为17.27、16.08，P<0.01）。转染24 h，P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞磷酸化VEGFR2和磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+阴性对照siRNA组（P<0.01），P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P<0.01），空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞VEGFR2、磷酸化ERK1/2蛋白表达量均明显高于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组（P<0.05或P<0.01）。转染24 h，P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数为（720±62）个，明显多于空载腺病毒+阴性对照siRNA组的（428±38）个、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组的（364±57）个（P值均<0.01）；P311腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构总长度为（21 241±1 139）μm，明显长于空载腺病毒+阴性对照siRNA组的（17 005±1 156）μm、P311腺病毒+siRNA-VEGFR2组的（13 494±2 465）μm（P值均<0.01）。空载腺病毒+阴性对照siRNA组细胞管状结构节点数明显多于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组的（310±75）个（P<0.01），管状结构总长度明显长于空载腺病毒+siRNA-VEGFR2组的（11 600±2 776）μm（P<0.01）。处理2 h，P311腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+DMSO组、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P值均<0.01），空载腺病毒+DMSO组细胞磷酸化ERK1/2蛋白表达量明显高于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组（P<0.05）。处理2 h，P311腺病毒+DMSO组细胞管状结构节点数为（726±72）个，明显多于空载腺病毒+DMSO组的（421±39）个、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组的（365±41）个（P值均<0.01）；P311腺病毒+DMSO组细胞管状结构总长度为（20 318±1 433）μm，明显长于空载腺病毒+DMSO组的（16 846±1 464）μm、P311腺病毒+ERK1/2抑制剂组的（15 114±1 950）μm（P值均<0.01）。空载腺病毒+DMSO组管状结构节点数明显多于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组的（317±67）个（P<0.01），管状结构总长度明显长于空载腺病毒+ERK1/2抑制剂组的（13 188±2 306）μm（P<0.01）。结论P311能够通过激活VEGFR2/ERK1/2信号通路发挥促进HMEC-1血管形成的作用。

简介：摘要目的探讨复合人表皮干细胞（ESC）的猪脱细胞真皮基质（ADM）对裸鼠全层皮肤缺损创面愈合的影响。方法采用实验研究方法。采用数码相机拍照观察猪ADM形态，采用苏木精-伊红（HE）染色观测猪ADM中细胞残留，采用扫描电子显微镜观察猪ADM表面结构，采用红外光谱仪分析猪ADM二级结构，采用动态光散射粒度分析仪分析猪ADM粒径，采用纳米粒度电位仪分析猪ADM电位。采用倒置荧光显微镜观察猪ADM在培养基中放置30 min、1 d、5 d的形态（样本数为2）；采用随机数字表法（分组方法下同）将猪ADM分为5 min组、10 min组、20 min组、30 min组、60 min组、120 min组，常温静置相应时间，称量法计算吸水量（样本数为3）；将Swiss小鼠胚胎成纤维细胞（Fb）分为仅有培养基的空白对照组和另加入相应终质量浓度的ADM浸提液的50.0 g/L ADM浸提液组、37.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、6.5 g/L ADM浸提液组，分别于培养24、48、72 h，采用细胞计数试剂盒8法检测细胞增殖率并进行细胞毒性分级（样本数为5）；将1只6周龄雄性SD大鼠红细胞分为生理盐水组、超纯水组及添加相应终质量浓度猪ADM浸提液的5 mg/mL ADM浸提液组、10 mg/mL ADM浸提液组、15 mg/mL ADM浸提液组，于反应3 h，采用酶标仪检测血红蛋白的吸光度值代表猪ADM血液相容性（样本数为3）。从陆军军医大学（第三军医大学）第一附属医院泌尿外科2020年7月收治的1名6岁健康男童包皮环切术后废弃包皮中分离培养ESC并采用流式细胞术鉴定。混合培养法构建复合ESC的猪ADM（以下简称ESC/ADM）颗粒，培养3 d后采用HE染色和激光扫描共聚焦显微镜观察ESC/ADM复合效果。将36只7~8周龄雄性无胸腺裸鼠分成单纯磷酸盐缓冲液（PBS）组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组，每组9只，并建立全层皮肤缺损创面模型，伤后即刻，创面均一次性采用相应试剂处理。分别于伤后1、7、11、15 d，观察创面愈合情况并计算创面愈合率（样本数为3）；伤后7 d，行HE染色观察创面上皮化情况并测量未上皮化长度（此处及以下样本数均为4）；伤后11 d，行Masson染色观察创面胶原沉积和真皮化情况并计算创面切面真皮面积，行免疫荧光染色并计算创面表达ESC特异性标志物CD49f的细胞数，行实时荧光定量反转录PCR检测创面移植ESC的3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的mRNA表达。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、重复测量方差分析、LSD-t检验。结果猪ADM为白色微粒状，内部无细胞存在，由网状结构组成，结构排列无序，表面粗糙；猪ADM分别在1 659、1 549、1 239 cm-1波数处出现吸收峰；猪ADM在溶液中主要粒径分布在500~700 nm；猪ADM表面带负电荷。放置30 min、1 d、5 d，猪ADM均形态相对稳定；放置30~120 min猪ADM吸水量保持相对高水平。6.5 g/L ADM浸提液组、12.5 g/L ADM浸提液组、25.0 g/L ADM浸提液组小鼠胚胎Fb在培养24 h细胞毒性分级为1级，其余各组各时间点细胞毒性分级均为0级。反应3 h，超纯水组红细胞中血红蛋白的吸光度值明显高于生理盐水组和15 mg/mL ADM浸提液组（t值分别为8.14、7.96，P<0.01）。第4代细胞常规培养3 d形态呈鹅卵石样且低表达CD71和高表达CD49f的被鉴定为ESC。猪ADM颗粒上有ESC附着、生长。伤后1 d，单纯PBS组、单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面大小基本一致。伤后7、11、15 d，各组裸鼠创面收缩，其中单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面收缩明显。伤后7 d，单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（t值分别为2.83、4.72，P<0.05或P<0.01）；伤后11 d，ESC/ADM组裸鼠创面愈合率明显高于单纯PBS组（t=4.86，P<0.01）；伤后15 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面愈合率均明显高于单纯PBS组（t值分别为2.71、2.90、3.23，P<0.05）。伤后7 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面未上皮化长度分别为（816±85）、（635±66）、（163±32）μm，明显短于单纯PBS组的（1 199±43）μm（t值分别为5.69、10.19、27.54，P<0.01）。伤后11 d，单纯ADM组、单纯ESC组、ESC/ADM组裸鼠创面切面真皮面积明显大于单纯PBS组（t值分别为27.14、5.29、15.90，P<0.01）；单纯ADM组和ESC/ADM组裸鼠创面的胶原生成比单纯PBS组明显，单纯ESC组和单纯PBS组相近。伤后11 d，单纯ESC组和ESC/ADM组裸鼠创面中CD49f表达阳性数量分别为（135±7）、（185±15）个，GAPDH的mRNA表达阳性；单纯PBS组、单纯ADM组裸鼠创面均无CD49f、GAPDH的mRNA表达。结论ESC/ADM颗粒能够促进裸鼠全层皮肤缺损创面愈合，这可能与其提高了ESC移植后的存活率和ADM促进了真皮结构重排、血管新生有关。

简介：无

简介：摘要目的探讨成人真皮成纤维细胞(HDF-a)中转化生长因子β1(TGF-β1)对Meox1的转录调控机制及细胞迁移功能的影响。方法(1)取HDF-a系细胞，用RPMI 1640完全培养基培养(下称常规培养)，将细胞分为TGF-β1刺激组和空白对照组。TGF-β1刺激组细胞加入10 μL质量浓度为1 mg/μL的TGF-β1刺激，空白对照组加入等量磷酸盐缓冲液。培养72 h，取2组部分细胞进行转录组测序，筛选出2组差异表达比值≥2且P<0.01的基因，对差异基因进行功能富集分析与京都基因和基因组百科全书代谢途径分析，记录Meox1每百万转录本(TPM)表达值，样本数为3；取2组部分细胞，采用实时荧光定量反转录PCR(RT-PCR)法检测Meox1 mRNA表达，样本数为3。(2)取对数生长期HDF-a系细胞(细胞生长期下同)常规培养，分为空质粒组和Smad2过表达组、Smad3过表达组、Smad4过表达组，分别转染2 μg pcDNA3.1空质粒和各自搭载Smad2、Smad3、Smad4的pcDNA3.1质粒，转染6 h后常规培养48 h，实时荧光定量RT-PCR法检测各组细胞中Meox1 mRNA的表达，样本数为3。(3)取HDF-a系细胞常规培养，同实验(1)分组处理，常规培养72 h，采用染色质免疫共沉淀-定量PCR(ChIP-qPCR)法检测2组细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度，样本数为3。(4)取HDF-a系细胞常规培养，分为阴性干扰组、小干扰RNA(siRNA)-Smad2组、siRNA-Smad3组、siRNA-Smad4组和空质粒组、Smad2过表达组、Smad3过表达组、Smad4过表达组，分别转染50 μmol/L随机siRNA、siRNA-Smad2、siRNA-Smad3、siRNA-Smad4和2 μg pcDNA3.1空质粒及各自搭载Smad2、Smad3、Smad4的pcDNA3.1质粒，转染6 h后常规培养48 h，ChIP-qPCR法检测相应组别细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度，样本数为3。(5)取2个批次HDF-a系细胞常规培养，均分为阴性干扰组、siRNA-Meox1组、空质粒组、Meox1过表达组，分别转染50 μmol/L随机siRNA、siRNA-Meox1和2 μg pcDNA3.1空质粒、搭载Meox1的pcDNA3.1质粒，转染6 h后常规培养24 h，1个批次细胞进行划痕实验，划痕后24 h观察划痕宽度，与划痕后即刻对比划痕愈合宽度；1个批次细胞进行Transwell实验，常规培养24 h，计数迁移细胞，样本数为3。(6)2018年1月—2019年6月，陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院收治3例烧伤后8～12个月增生性瘢痕患者(男2例、女1例，年龄35～56岁)，取其术中切除的瘢痕组织和瘢痕边缘附带正常皮肤组织，行免疫组织化学染色，观察Meox1蛋白表达分布。对数据行单因素方差分析、独立样本t检验。结果(1)培养72 h，2组细胞差异表达明显的基因共843个，涉及组织修复、细胞迁移、炎性细胞趋化诱导过程等功能以及肿瘤坏死因子、白细胞介素17、细胞外基质受体等潜在的信号通路；空白对照组细胞测序结果的Meox1 TPM表达值为45.9±1.9，显著低于TGF-β1刺激组的163.1±29.5(t＝6.88，P<0.01)。培养72 h，空白对照组细胞Meox1 mRNA表达量为1.00±0.21，显著低于TGF-β1刺激组的11.00±3.61(t＝4.79，P<0.01)。(2)培养48 h，Smad2过表达组、Smad3过表达组和Smad4过表达组细胞中Meox1 mRNA表达量分别为198.70±11.02、35.47±4.30、20.27±2.50，均显著高于空质粒组的1.03±0.19(t＝31.07、13.80、13.12，P<0.01)。(3)培养72 h，TGF-β1刺激组细胞中Smad2、Smad3和Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度均显著高于空白对照组(t＝12.99、41.47、29.10，P<0.01)。(4)培养48 h，阴性干扰组细胞中Smad2蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.200 000±0.030 000)%，显著高于siRNA-Smad2组的(0.000 770±0.000 013)%(t＝11.67，P<0.01)；空质粒组细胞中Smad2蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.200 000±0.040 000)%，显著低于Smad2过表达组的(0.700 000±0.090 000)%(t＝8.85，P<0.01)。阴性干扰组细胞中Smad3蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.500 0±0.041 3)%，显著高于siRNA-Smad3组的(0.006 0±0.001 3)%(t＝17.79，P<0.01)；空质粒组细胞中Smad3蛋白在Meox1启动子上的富集度为(0.470 0±0.080 0)%，显著低于Smad3过表达组的(1.100 0±0.070 0)%(t＝9.93，P<0.01)。阴性干扰组细胞中Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度与siRNA-Smad4组相近(t＝2.11，P>0.05)，空质粒组细胞中Smad4蛋白在Meox1启动子上的富集度与Smad4过表达组相近(t＝0.60，P>0.05)。(5)划痕后24 h，siRNA-Meox1组细胞划痕愈合宽度较阴性干扰组窄，Meox1过表达组细胞划痕愈合宽度较空质粒组宽。培养24 h，阴性干扰组迁移细胞数显著多于siRNA-Meox1组(t＝9.12，P<0.01)，空质粒组迁移细胞数显著少于Meox1过表达组(t＝8.99，P<0.01)。(6)烧伤后增生性瘢痕患者瘢痕组织中Meox1蛋白表达明显高于正常皮肤组织。结论在HDF-a系细胞中，TGF-β1通过Smad2/3转录调控Meox1表达，进而促进细胞迁移。

简介：摘要目的探讨白细胞介素17A(IL-17A)调控小鼠角质形成细胞(KC)表达IL-1β和IL-23的机制。方法从400只新生雌雄不限C57BL/6野生型小鼠皮肤中分离原代KC，用含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养于24孔板中，用于以下实验。(1)取细胞，采用随机数字表法(分组方法下同)分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组、IL-17A刺激组，分别加入10 μL的PBS、质量浓度为100 ng/mL的IL-17A培养6 h，采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中IL-1β和IL-23 mRNA表达水平，每组3个样本。(2)取细胞，分为二甲基亚砜(DMSO)对照组、IL-17A＋DMSO组、IL-17A＋核因子κB抑制剂组、IL-17A＋信号转导及转录激活因子3(STAT3)抑制剂组、IL-17A＋胞外信号调节激酶1(ERK1)抑制剂组、IL-17A＋ERK2抑制剂组、IL-17A＋c-Jun氨基端激酶(JNK)抑制剂组，分别加入相应试剂，各试剂体积均为10 μL，IL-17A质量浓度为100 ng/mL，核因子κB、STAT3、ERK1、ERK2、JNK信号通路抑制剂PDTC、S3I-201、SCH772984、SCH772984、SP600125物质的量浓度分别为5 μmol/L、100 μmol/L、4 nmol/L、1 nmol/L、10 μmol/L，均培养6 h。采用实时荧光定量反转录PCR法检测细胞中IL-1β和IL-23 mRNA表达水平，每组3个样本。(3)取细胞，同实验(1)分组处理，采用蛋白质印迹法检测细胞中核因子κB磷酸化、STAT3磷酸化、ERK磷酸化、JNK磷酸化水平，每组3个样本。对数据行双尾Student t检验、单因素方差分析、t检验和Bonferroni校正。结果(1)培养6 h，与PBS对照组比较，IL-17A刺激组细胞中IL-1β和IL-23 mRNA表达水平均明显升高(t＝13.46、6.72，P<0.01)。(2)培养6 h，DMSO对照组、IL-17A＋DMSO组、IL-17A＋核因子κB抑制剂组、IL-17A＋STAT3抑制剂组、IL-17A＋ERK1抑制剂组、IL-17A＋ERK2抑制剂组、IL-17A＋JNK抑制剂组细胞中IL-1β与IL-23 mRNA表达水平分别为1.00±0.11、4.01±0.32、0.32±0.06、1.76±0.43、3.62±0.24、3.80±0.43、4.26±0.74和1.03±0.29、4.08±0.34、4.76±0.38、4.70±0.21、1.06±0.42、0.92±0.21、0.39±0.05。与DMSO对照组比较，IL-17A＋DMSO组细胞中IL-1β和IL-23 mRNA表达水平均明显升高(t＝9.24、12.60，P<0.01)。与IL-17A＋DMSO组比较，IL-17A＋核因子κB抑制剂组与IL-17A＋STAT3抑制剂组细胞中IL-1β mRNA表达水平均明显下降(t＝11.34、6.91，P<0.01)，IL-17A＋ERK1抑制剂组、IL-17A＋ERK2抑制剂组和IL-17A＋JNK抑制剂组细胞中IL-23 mRNA表达水平均明显下降(t＝12.44、13.03、15.21，P<0.01)。(3)培养6 h，与PBS对照组比较，IL-17A刺激组细胞中核因子κB磷酸化、STAT3磷酸化、ERK磷酸化、JNK磷酸化水平均明显升高。结论IL-17A分别通过促进核因子κB、STAT3信号通路磷酸化与ERK、JNK信号通路磷酸化促进小鼠KC转录表达IL-1β与IL-23。

简介：摘要目的了解树突状表皮T淋巴细胞(DETC)对小鼠创缘表皮细胞增殖和凋亡的影响及其在创面愈合中的作用。方法选取无特殊病原体(SPF)级野生型C57BL/6健康8～12周龄雄性小鼠28只、SPF级8～12周龄T淋巴细胞受体δ敲除(TCR δ－/－)雄性小鼠60只用于如下实验。(1)采用随机数字表法取8只野生型小鼠分离表皮细胞、原代培养DETC，并于培养即刻及培养15、30 d行DETC形态学观察和采用流式细胞仪检测纯度。(2)采用随机数字表法取5只野生型小鼠、5只TCR δ－/－小鼠，分别设为野生型对照组、TCR δ－/－组，每只小鼠背部制作直径6 mm圆形全层皮肤缺损创面。观察伤后即刻及伤后2、4、6、8、10 d创面愈合情况、计算剩余创面面积百分比。(3)同实验(2)取小鼠，分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘组织进行苏木精-伊红染色，检测新生上皮长度。(4)同实验(2)取小鼠，分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘表皮组织，采用蛋白质印迹法检测增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，评估表皮细胞增殖情况。(5)同实验(2)取小鼠，分组并制作全层皮肤缺损模型。伤后3 d取创缘的表皮组织消化成单细胞悬液，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。(6)取40只TCR δ－/－小鼠，同前行实验(2)～(5)检测，并采用随机数字表法分为TCR δ－/－对照组和TCR δ－/－＋DETC组，每个实验每组5只小鼠。其中小鼠背部同前造成全层皮肤缺损，TCR δ－/－＋DETC组小鼠伤后即刻于创缘多点注射1×105个DETC(溶解于100 μL磷酸盐缓冲液，纯度超过90%)，TCR δ－/－对照组小鼠同法注射等体积磷酸盐缓冲液。对数据行重复测量方差分析、t检验及Bonferroni校正。结果(1)随着培养时间的延长，DETC树突状突起的数量逐渐增多。培养即刻，4.67%的细胞是T淋巴细胞，这部分T淋巴细胞中94.10%为DETC。培养15 d时DETC纯度达18.50%，培养30 d时DETC纯度达98.70%。(2)伤后即刻，TCR δ－/－组、野生型对照组小鼠的创面情况相似；TCR δ－/－组小鼠伤后2～10 d的创面愈合速度慢于野生型对照组。与野生型对照组小鼠比较，TCR δ－/－组小鼠伤后2、4、6、8、10 d剩余创面面积百分比均明显升高(t＝3.492、4.425、4.170、4.780、7.318, P<0.01)。(3)TCR δ－/－组小鼠伤后3 d创缘新生上皮长度为(359±15)μm，明显短于野生型对照组的(462±26)μm(t＝3.462，P<0.01)。(4)TCR δ－/－对照组小鼠伤后即刻的创面情况与TCR δ－/－＋DETC组相似；TCR δ－/－＋DETC组小鼠伤后2～10 d的创面愈合速度明显快于TCR δ－/－对照组。与TCR δ－/－对照组比较，TCR δ－/－＋DETC组小鼠伤后2、4、6、8、10 d剩余创面面积百分比明显降低(t＝2.308、3.725、2.698、3.707、6.093, P<0.05或P<0.01)。(5)TCR δ－/－＋DETC组小鼠伤后3 d创缘新生上皮长度为(465±31)μm，明显长于TCR δ－/－对照组的(375±21)μm(t＝2.390，P<0.05)。(6)伤后3 d，TCR δ－/－组小鼠创缘表皮细胞的PCNA表达量为1.25±0.04，明显低于野生型对照组的2.01±0.09(t＝7.415，P<0.01)。(7)伤后3 d，TCR δ－/－＋DETC组小鼠创缘表皮细胞的PCNA表达量为1.62±0.08，明显高于TCR δ－/－对照组的1.05±0.14(t＝3.561，P<0.05)。(8)伤后3 d，TCR δ－/－组小鼠创缘表皮细胞凋亡率为(16.1±1.4)%，明显高于野生型对照组的(8.1±0.6)%(t＝5.363，P<0.01)。(9)伤后3 d，TCR δ－/－＋DETC组小鼠创缘的表皮细胞凋亡率为(11.4±1.0)%，明显低于TCR δ－/－对照组的(15.4±1.4)%(t＝2.377，P<0.05)。结论DETC可通过促进小鼠创缘表皮细胞的增殖、抑制其凋亡，参与创面愈合过程。

简介：摘要目的探讨树突状表皮T细胞(DETC)调节小鼠表皮干细胞增殖和分化，促进小鼠全层皮肤缺损创面愈合的机制。方法(1)取10只8周龄野生型雄性C57BL/6(品系和性别下同)小鼠，剪取整块背部皮肤，分离培养DETC。取5只8周龄野生型小鼠设为野生对照组，5只8周龄T细胞受体(TCR)δ-/-型小鼠设为TCRδ-/-对照组，于背部脊柱线两侧各制作一个直径为6 mm的全层皮肤缺损创面，伤后不做任何处理。另取15只8周龄TCRδ-/-型小鼠，按随机数字表法(分组方法下同)分为磷酸盐缓冲液(PBS)组、DETC组和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)组，每组5只，同前制作全层皮肤缺损创面，伤后即刻，分别于每个创面周围皮下注射10 μL无菌PBS、DETC(细胞浓度为1×106个/mL)、5 mg/mL重组小鼠IGF-Ⅰ。伤后2、4、6、8 d，计算剩余创面面积百分比。(2)取3只8周龄野生型小鼠，设为野生对照组。另取9只8周龄TCRδ-/-型小鼠，分为TCRδ-/-对照组、PBS组和DETC组，每组3只，同实验(1)制作全层皮肤缺损创面。伤后3 d，化学发光成像分析仪检测创缘表皮组织IGF-Ⅰ蛋白表达水平。(3)取3只8周龄野生型小鼠，设为野生对照组。另取6只8周龄TCRδ-/-型小鼠，分为PBS组和DETC组，每组3只，同实验(1)制作全层皮肤缺损创面。伤后3 d，取创缘表皮组织，分离DETC，流式细胞仪检测表达IGF-Ⅰ的DETC百分比。(4)同实验(2)取小鼠并分为野生对照组、PBS组、DETC组、IGF-Ⅰ组，在任意一侧耳朵朝内耳方向做一长3 cm的直线切口，深达皮肤全层。野生对照组小鼠伤后不进行任何处理，DETC组、IGF-Ⅰ组、PBS组小鼠伤后即刻分别于创面周围皮下注射10 μL DETC(细胞浓度为1×106个/mL)、5 mg/mL重组小鼠IGF-Ⅰ、无菌PBS。伤后12 d，取创缘表皮组织，免疫荧光染色观察角蛋白15阳性细胞数。(5)同实验(4)取小鼠并进行分组、处理。伤后12 d，取创缘表皮组织，免疫荧光染色观察角蛋白10阳性细胞数。(6)取20只3 d龄野生型小鼠(下同)，每个指标检测取5只，剪取全身皮肤，分离培养表皮干细胞，分为对照组、DETC共培养组。DETC共培养组细胞加入1 mL DETC(细胞浓度为1.25×106个/mL)，对照组细胞加入1 mL DETC培养基，培养3 d，流式细胞仪(下同)检测5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)阳性细胞百分比；培养5 d，检测CD49f＋CD71-细胞百分比、角蛋白14阳性细胞百分比；培养10 d，检测角蛋白10阳性细胞百分比。(7)取20只小鼠，每个指标检测取5只，分离培养表皮干细胞，分为对照组和IGF-Ⅰ组。IGF-Ⅰ组细胞加入1 mL重组小鼠IGF-Ⅰ(10 ng/mL)，对照组细胞加入1 mL无菌PBS，同实验(6)检测EdU阳性细胞百分比、CD49f＋CD71-细胞百分比、角蛋白14阳性细胞百分比、角蛋白10阳性细胞百分比。实验(6)和(7)各组样本数均为3。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、t检验。结果(1)伤后4、6、8 d，TCRδ-/-对照组小鼠剩余创面面积百分比显著高于野生对照组(t＝2.78、3.39、3.66，P<0.05或P<0.01)；DETC组、IGF-Ⅰ组小鼠剩余创面面积百分比显著低于PBS组(t＝2.61、3.21、3.88，2.84、2.91、2.49，P<0.05或P<0.01)。(2)伤后3 d，TCRδ-/-对照组小鼠创缘表皮组织中IGF-Ⅰ蛋白表达水平显著低于野生对照组(t＝17.34，P<0.01)。DETC组小鼠创缘表皮组织中IGF-Ⅰ蛋白表达水平显著高于PBS组(t＝11.71，P<0.01)。(3)伤后3 d，PBS组小鼠创缘表皮组织中表达IGF-Ⅰ的DETC百分比显著低于野生对照组和DETC组(t＝24.95、27.23，P<0.01)。(4)伤后12 d，PBS组小鼠创缘表皮组织中角蛋白15阳性细胞数显著少于野生对照组、DETC组和IGF-Ⅰ组(t＝17.97、11.95、7.63，P<0.01)。(5)PBS组小鼠创缘表皮组织中角蛋白10阳性细胞数显著多于野生对照组、DETC组和IGF-Ⅰ组(t＝11.59、9.51、3.48，P<0.05或P<0.01)。(6)DETC共培养组培养3 d EdU阳性细胞百分比、培养5 d CD49f＋CD71-细胞百分比、培养5 d角蛋白14阳性细胞百分比分别为(43.5±0.6)%、(66.5±0.5)%、(69.3±1.7)%，显著高于对照组的(32.3±1.3)%、(56.4±0.3)%、(54.9±1.3)%，t＝7.97、17.10、6.66，P<0.01。DETC共培养组培养10 d角蛋白10阳性细胞百分比为(55.7±0.7)%，显著低于对照组的(67.1±1.2)%，t＝8.34, P<0.01。(7)IGF-Ⅰ组培养3 d EdU阳性细胞百分比、培养5 d CD49f＋CD71-细胞百分比、培养5 d角蛋白14阳性细胞百分比分别为(42.1±0.9)%、(81.1±1.3)%、(66.8±1.0)%，显著高于对照组的(32.4±0.7)%、(74.9±0.7)%、(52.0±1.9)%，t＝8.39、4.24、7.25，P<0.05或P<0.01。IGF-Ⅰ组培养10 d角蛋白10阳性细胞百分比为(53.5±1.1)%，显著低于对照组的(58.2±0.3)%，t＝3.99, P<0.05。结论DETC通过分泌IGF-Ⅰ促进表皮干细胞的增殖和抗凋亡潜能并抑制其向终末期细胞分化，从而促进小鼠全层皮肤缺损创面愈合。

简介：摘要目的探讨白细胞介素4修饰的金纳米酶颗粒（IL-4-AuNP）对糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面愈合的作用及其机制。方法采用实验研究方法。改进文献中的方法合成金纳米酶颗粒（AuNP）及IL-4-AuNP，采用透射电子显微镜拍摄2种颗粒形貌并计算其粒径，采用纳米粒度电位仪和粒度分析仪分别检测2种颗粒的表面电位和水合粒径。采用过氧化氢检测试剂盒和超氧阴离子检测试剂盒检测IL-4-AuNP的过氧化氢清除率和超氧阴离子清除率。取小鼠成纤维细胞系3T3细胞，采用随机数字表法（下同）将其分为空白对照组、仅使用过氧化氢处理的单纯过氧化氢组、先使用IL-4-AuNP处理0.5 h再使用过氧化氢处理的过氧化氢+IL-4-AuNP组，培养24 h后，采用免疫荧光法检测细胞活性氧水平，采用细胞计数试剂盒8检测细胞相对存活率。取Raw264.7小鼠巨噬细胞，将其分为空白对照组和用IL-4-AuNP处理的IL-4-AuNP组，培养24 h后，采用免疫荧光法观测细胞中精氨酸酶1（Arg-1）的表达。取12只8~10周龄雄性BALB/c小鼠（小鼠周龄、性别、品系下同），分为IL-4-AuNP组和空白对照组，分别作相应处理。在分组处理第16天，采集小鼠全血分析全血中白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）、血红蛋白水平与血小板计数和天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、尿素与肌酐水平；采用苏木精-伊红（HE）染色观察小鼠心、肝、脾、肺和肾组织的炎症、出血或坏死情况。另取36只鼠，制作糖尿病模型后，在其背部制作全层皮肤缺损创面，将创面分为空白对照组、单纯AuNP组和IL-4-AuNP组，每组12只鼠，分别进行相应处理。于分组处理第0（即刻）、4、9、15天，观察创面情况并计算创面面积。分组处理第9天，采用HE染色检测创面中新生上皮长度和肉芽组织厚度。分组处理第15天，采用免疫荧光法检测创面组织中活性氧水平及Arg-1阳性细胞数。样本数均为6。对数据行独立样本t检验、校正t检验、Tukey检验或Dunnett T3检验。结果AuNP及IL-4-AuNP大小均匀，其粒径、表面电位、水合粒径分别为（13.0±2.1）、（13.9±2.5）nm及（-45.8±3.2）、（-20.3±2.2）mV与（14±3）、（16±4）nm。IL-4-AuNP的过氧化氢清除率和超氧阴离子清除率分别为（69±4）%和（52±5）%。分组培养24 h后，单纯过氧化氢组3T3细胞活性氧水平明显高于空白对照组（q=26.12，P<0.05）；过氧化氢+IL-4-AuNP组细胞活性氧水平明显低于单纯过氧化氢组（q=25.12，P<0.05），而与空白对照组接近（P>0.05）。分组培养24 h后，过氧化氢+IL-4-AuNP组3T3细胞相对存活率明显高于单纯过氧化氢组（t=51.44，P<0.05）。分组培养24 h后，IL-4-AuNP组Raw264.7细胞Arg-1的表达明显高于空白对照组（t'=8.83，P<0.05）。分组处理第16天，空白对照组和IL-4-AuNP组小鼠的WBC、RBC、血红蛋白水平与血小板计数和AST、ALT、尿素与肌酐水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）；IL-4-AuNP组小鼠的心、肝、脾、肺、肾等重要脏器中均未观察到明显的炎症、出血或坏死，与空白对照组相比，无明显变化。分组处理第0、4天，空白对照组、单纯AuNP组和IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面面积比较差异均无统计学意义（P>0.05）。分组处理第9天，单纯AuNP组和IL-4-AuNP组创面面积均明显小于空白对照组（q值分别为9.45、14.87，P<0.05），IL-4-AuNP组创面面积显著小于单纯AuNP组（q=5.42，P<0.05）。分组处理第15天，单纯AuNP组和IL-4-AuNP组创面面积均明显小于空白对照组（q值分别为4.84、20.64，P<0.05），IL-4-AuNP组创面面积显著小于单纯AuNP组（q=15.80，P<0.05）；且IL-4-AuNP组创面部位红、肿等炎症反应较其他2组明显减轻。分组处理第9天，相比于空白对照组和单纯AuNP组，IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面中新生上皮长度明显更长（P值均<0.05），创面中的肉芽组织厚度显著增厚（q值分别为11.33、9.65，P值均<0.05）。分组处理第15天，相比于空白对照组，单纯AuNP组和IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面组织的活性氧水平均明显降低（P<0.05）。分组处理第15天，IL-4-AuNP组糖尿病小鼠创面中Arg-1阳性的细胞数显著多于空白对照组和单纯AuNP组（P值均<0.05）。结论IL-4-AuNP在体使用安全，可以通过清除活性氧改善氧化微环境和诱导巨噬细胞向M2表型极化，促进糖尿病小鼠全层皮肤缺损创面高效愈合与修复再生。

简介：无