简介：摘要目的探讨含人脐血来源富血小板血浆（HUCB-PRP）的海藻酸钠-明胶（AG）生物墨水（称为HUCB-PRP-AG生物墨水）的可打印性能和细胞相容性，及该生物墨水的三维打印组织治疗裸鼠全层皮肤缺损创面的效果。方法采用实验研究方法。制备含体积分数2.5%、5.0%、10.0%HUCB-PRP的HUCB-PRP-AG生物墨水，分别命名为1P-AG、2P-AG、4P-AG。取AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG，观察室温下外观，采用旋转流变仪检测黏度、储能模量和损耗模量。利用以上4种生物墨水分别进行三维生物打印并观察打印组织外观（后续使用交联后打印组织），将4种打印组织分别与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在Transwell小室内用HUVEC专用培养基共培养24 h，采用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖水平（样本数为3）；将4种打印组织分别用DMEM培养基培养12、24、48 h，进行干燥称重并计算降解率（样本数为3）；将1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织分别用磷酸盐缓冲液培养0.5、24.0、48.0 h，采用酶联免疫吸附测定法检测培养上清液中血管内皮生长因子（VEGF）的表达（样本数为5）。取16只6~8周龄雌性BALB/c-NU裸鼠建立背部全层皮肤缺损创面模型，分为创面仅覆盖医用水胶体敷料的常规对照组和另予HUCB-PRP滴加的HUCB-PRP组、AG打印组织覆盖的AG组、4P-AG打印组织覆盖的4P-AG组（每组4只），观察每组3只裸鼠伤后4、8、14 d创面愈合情况并计算创面愈合率；取每组剩余裸鼠伤后8 d创面组织，行苏木精-伊红染色后观察组织病理学改变，行免疫组织化学染色后观察CD31阳性新生血管情况。对数据行重复测量方差分析、LSD检验及Bonferroni校正。结果在室温下，AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG均呈半透明液态；AG为淡黄色，1P-AG、2P-AG、4P-AG均为淡红色但颜色依次逐渐加深。在温度10 ℃和剪切率0.1~10.0 s-1范围内，AG、1P-AG、2P-AG、4P-AG的黏度均随着剪切率的增加而减小；在温度10 ℃和角频率1~100 rad/s范围内，4种生物墨水的储能模量均大于损耗模量。4种生物墨水打印组织的分辨率与形态均相近。与1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平分别为0.885±0.030、1.126±0.032、1.156±0.045，均明显高于与AG打印组织共培养的HUVEC的0.712±0.019（P<0.01）；与2P-AG、4P-AG打印组织共培养24 h的HUVEC增殖水平均明显高于与1P-AG打印组织共培养的HUVEC（P<0.01）。1P-AG、2P-AG、4P-AG打印组织培养12、24、48 h的降解率均明显高于AG打印组织（P<0.01）；2P-AG、4P-AG打印组织培养24、48 h的降解率均明显高于1P-AG打印组织（P<0.01）；4P-AG打印组织培养12 h的降解率明显高于1P-AG打印组织（P<0.01），培养24、48 h的降解率均明显高于2P-AG打印组织（P<0.01）。培养0.5、24.0、48.0 h，2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显高于1P-AG打印组织（P<0.01），1P-AG和2P-AG打印组织培养上清液中VEGF表达量均明显低于4P-AG打印组织（P<0.01）。常规对照组与HUCB-PRP组裸鼠伤后8 d创面较伤后4 d干燥且缩小，HUCB-PRP组裸鼠伤后14 d创面较常规对照组缩小且无结痂；AG组、4P-AG组裸鼠伤后4 d创面上打印组织明显降解且创面无明显渗出，伤后8 d创面明显上皮化且缩小，伤后14 d创面无结痂；4P-AG组裸鼠伤后14 d创面完全上皮化。与常规对照组比较，AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率明显降低（P<0.05），HUCB-PRP组、4P-AG组裸鼠伤后各时间点及AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高（P<0.01）；与HUCB-PRP组比较，AG组裸鼠伤后4、8 d及4P-AG组裸鼠伤后4 d创面愈合率均明显降低（P<0.01），AG组裸鼠伤后14 d及4P-AG组裸鼠伤后8、14 d创面愈合率均明显升高（P<0.01）；4P-AG组裸鼠伤后各时间点创面愈合率均明显高于AG组（P<0.01）。伤后8 d，常规对照组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管，HUCB-PRP组裸鼠创面组织可见大量炎症细胞浸润、丰富新生微血管以及较多CD31阳性新生血管，AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、少量新生微血管以及少量CD31阳性新生血管，4P-AG组裸鼠创面组织可见轻度炎症浸润、大量新生微血管以及大量CD31阳性新生血管。结论HUCB-PRP-AG生物墨水具备良好的可打印性能和细胞相容性，其三维打印组织可促进裸鼠全层皮肤缺损创面血管化，加速创面愈合。

简介：摘要目的制备含氧化石墨烯（GO）的甲基丙烯酸酐化明胶（GelMA）水凝胶并探讨原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶对小鼠全层皮肤缺损创面血管化的影响。方法采用实验研究方法。将0.2 mg/mL的GO溶液50 μL均匀涂抹于导电胶上，烘干后于场发射扫描电子显微镜下观察GO的结构和大小。将人皮肤成纤维细胞（HSF）分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO（不加GO溶液，下同）组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组、10.0 μg/mL GO组，用酶标仪检测细胞培养48 h的吸光度值，以此表示细胞增殖活性（样本数为6）。将HSF和人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）分别分为采用相应终质量浓度GO处理的0 μg/mL GO组、0.1 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组，采用划痕试验检测划痕后24、36 h HSF的迁移率（样本数为5）及划痕后12 h HUVEC的迁移率（样本数为3），采用酶联免疫吸附测定法检测培养4、6、8 h后HSF分泌的血管内皮生长因子（VEGF）水平（样本数为3）。将配制的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶设为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，观察其交联前后的性状，检测用磷酸盐缓冲液浸泡3、7 d后GO的释放情况（样本数为3）。在16只6周龄雌性C57BL/6小鼠背部制作全层皮肤缺损创面，将采用原位交联的含相应终质量浓度GO的GO-GelMA复合水凝胶处理的小鼠按随机数字表法分为0 μg/mL GO复合水凝胶组、0.1 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组，每组4只，观察治疗3、7、14 d创面大体情况并计算创面愈合率，采用激光多普勒血流仪检测治疗3、7、14 d创面血流灌注并计算平均灌注单位（MPU）比值，采用苏木精-伊红染色观察治疗7 d创面血管新生情况并计算血管密度（样本数均为3）。取0 μg/mL GO复合水凝胶组和0.1 μg/mL GO复合水凝胶组治疗7 d的创面组织，采用苏木精-伊红染色观察GO分布与血管新生的关系（样本数为3），行免疫组织化学染色后观察VEGF的表达。对数据行重复测量方差分析、单因素方差分析、Tukey法。结果GO为多层片状结构，宽度约为20 μm、长度约为50 μm。培养48 h，10.0 μg/mL GO组HSF的吸光度值明显低于0 μg/mL GO组（q=7.64，P<0.01）。划痕后24 h，4组HSF迁移率相近（P>0.05）；划痕后36 h，0.1 μg/mL GO组HSF迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.48、10.81、10.20，P值均<0.01）。划痕后12 h，0.1 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显高于0 μg/mL GO组、1.0 μg/mL GO组、5.0 μg/mL GO组（q值分别为7.11、8.99、14.92，P值均<0.01），5.0 μg/mL GO组HUVEC迁移率明显低于0 μg/mL GO组和1.0 μg/mL GO组（q值分别为7.81、5.33，P<0.05或P<0.01）。培养4、6 h，4组HSF的VEGF表达均相近（P>0.05）；培养8 h，0.1 μg/mL GO组HSF的VEGF表达明显高于0 μg/mL GO组和5.0 μg/mL GO组（q值分别为4.75、4.48，P值均<0.05）。4组GO-GelMA复合水凝胶在交联前均呈红色液体状，交联后呈微黄色凝胶状且流动性无明显差异。0 μg/mL GO复合水凝胶组复合水凝胶各时间点均无GO释放，其余3组GO-GelMA复合水凝胶中的GO于浸泡3 d部分释放，至浸泡7 d全部释放。治疗3~14 d，4组小鼠创面可见水凝胶敷料覆盖在位并保持湿润，创面逐渐愈合。治疗3、7、14 d，4组小鼠创面愈合率均相近（P>0.05）。治疗3 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面MPU比值明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为10.70、11.83、10.65，P<0.05或P<0.01）。治疗7、14 d，4组小鼠创面MPU比值均相近（P>0.05）。0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面治疗7 d的MPU比值明显低于治疗3 d（q=14.38，P<0.05），治疗14 d的MPU比值明显低于治疗7 d（q=27.78，P<0.01）。治疗7 d，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度为每200倍视野下（120.7±4.1）根，明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组、1.0 μg/mL GO复合水凝胶组、5.0 μg/mL GO复合水凝胶组的每200倍视野下（61.7±1.3）、（77.7±10.2）、（99.0±7.9）根（q值分别为12.88、7.79、6.70，P值均<0.01）；1.0 μg/mL GO复合水凝胶组和5.0 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面新生血管密度均明显高于0 μg/mL GO复合水凝胶组（q值分别为5.10、6.19，P<0.05）。治疗7 d，相较于0 μg/mL GO复合水凝胶组，0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中成簇新生血管更多，且聚集于GO附近；0.1 μg/mL GO复合水凝胶组小鼠创面中GO和新生血管分布区域有大量VEGF表达。结论GO质量浓度低于10.0 μg/mL对HSF增殖活性无明显影响，0.1 μg/mL的GO能够促进HSF和HUVEC迁移，能促进HSF分泌VEGF。原位光聚合GO-GelMA复合水凝胶敷料能够通过促进小鼠全层皮肤缺损创面血管新生，增加创面早期血流灌注，且GO对新生血管有富集作用，其机制可能与GO促进创面细胞分泌VEGF相关。