简介：摘要目的观察巨噬细胞耐多药结核分枝杆菌(multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis, MDR-Mtb)感染模型的吞噬和杀菌功能特点，探讨其在吞噬杀菌过程中免疫应答和代谢功能的变化，为完善巨噬细胞在耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)发生和发展中的作用机制提供依据。方法分别建立巨噬细胞MDR-Mtb和H37Rv株感染模型，采用菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)计数、液相芯片技术和Cholesterol Assay试剂盒分别观察MDR-Mtb对巨噬细胞吞噬和杀菌功能、分泌细胞因子[Th1因子(IL-12/23 p40、IL-27和TNF-α)、Th2因子(IL-6和IL-10)]和胆固醇代谢的影响。采用SPSS25.0软件进行统计学分析，应用均值±标准差(Mean±SD)表示，比较采用t检验或F检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果(1)MDR-Mtb感染巨噬细胞后，胞内CFU计数逐渐增高，至感染后24 h达峰值；胞外CFU计数逐渐降低，至感染后24 h达低值。感染后48 h，胞内CFU计数较感染后24 h降低，胞外CFU计数则较感染后24 h增高(P<0.05)，均与感染后4 h相接近(P>0.05)。感染后8~48 h，MDR-TB组胞内CFU计数均低于H37Rv组，而胞外CFU计数则高于H37Rv组(P<0.05)。(2)MDR-TB组巨噬细胞上清液IL-12/23 p40、IL-27、TNF-α、IL-6和IL-10表达量均高于空白对照组(P<0.05)。与感染后4 h相比较，仅感染后24 h、48 h的TNF-α和IL-6表达量增高(P<0.05)。与H37Rv组相比较，MDR-TB组感染后48 h的IL-12/23 p40和TNF-α及感染后24 h的IL-6表达量降低，而其感染后48 h的IL-27表达量则增高(P<0.05)。(3)MDR-TB组感染后24 h、48 h胆固醇的表达量较感染后4 h降低，且低于空白对照组(P<0.05)，但与H37Rv组各时间点胆固醇表达量相接近(P>0.05)。(4)当感染后24 h MDR-TB组胞内CFU计数达峰值时，仅TNF-α表达量达峰值；当感染后48 h MDR-TB组胞内CFU计数降低时仅IL-6表达量达峰值。当感染后MDR-TB组胞内CFU计数呈现先增高后降低的趋势时，胆固醇表达量呈现降低趋势。结论MDR-Mtb感染巨噬细胞后可诱导其吞噬和杀菌功能，刺激相关Th1和Th2因子高表达，利用和消耗胆固醇。但此作用弱于H37Rv标准株。

简介：摘要目的观察多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）对缺氧诱导的人视网膜微血管内皮细胞（hRMECs）功能的影响。方法采用三质粒系统构建慢病毒颗粒（LV）-PSF。LV-PSF体外感染hRMECs后通过流式细胞计数法测定其感染效率。应用实时定量PCR （RT-PCR）检测经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA表达水平。将实验分为体内和体外两部分。体内实验：7日龄健康C57B/L6小鼠20只，采用随机数字表法分为正常组、氧诱导视网膜病变（OIR）组、OIR+LV-空载体（Vec）组和OIR+LV-PSF组，每组5只。除正常组外，其余3组构建OIR模型。OIR组除缺氧刺激外，不做其余处理。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠分别玻璃体腔注射LV-Vec或LV-PSF。观察LV-PSF对视网膜新生血管（RNV）形成的影响。体外实验：将hRMECs分为正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs；缺氧组为缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs；空载组、PSF高表达组分别为用LV-Vec、LV-PSF感染48 h，再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs。采用MTT比色法观察PSF对细胞增生能力的影响。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验观察PSF对缺氧刺激下细胞迁移能力的影响。采用RT-PCR观察各组细胞中HIF-1α、VEGF及PSF的mRNA表达。结果成功构建可稳定高表达PSF的LV-PSF，流式细胞仪测定其感染效率为97%，RT-PCR测得经LV-PSF感染的hRMECs中PSF mRNA水平明显上调。体内实验：OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加（t=18.31、43.71），OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组（t=11.30）、OIR+LV-Vec组（t=15.47）明显减小，差异均有统计学意义（P <0.05 ）。体外实验：MTT比色法检测结果显示，缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显增强（t=2.57），PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组、空载组明显降低（t=5.26、5.46、3.73 ），差异均有统计学意义（P<0.05 ）。细胞划痕实验结果显示，缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激缺氧组与空载组细胞明显迁移（t=8.35、13.84，P<0.05 ）；而与缺氧组与空载组比较，PSF高表达组细胞迁移不明显（t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01 ，P <0.05）。Transwell小室实验结果显示，正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多，而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少（t=9.33、6.15，P<0.05）。RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加（t=15.23、21.09，P<0.05），PSF mRNA表达无明显变化（t=0.12、2.15，P<0.05 ）；与缺氧组、空载组比较，PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降（t=10.18、13.10，P<0.05），PSF mRNA表达明显增加（t=65.00、85.79，P<0.05 ）。结论PSF可减少OIR模型小鼠RNV面积。PSF可能通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制缺氧诱导的hRMECs增生和迁移。

简介：摘要：多声部器乐训练对于提高孩子们的音乐艺术素养以及陶冶情操都起到至关重要的积极意义，因此，对于孩子们的多声部器乐能力的培养应该从小重视起来。家长和学校从小学低段开始就要注意引导孩子们逐步跨入多声部器乐的音乐大门，通过家长、学校的培养，使其孩子们能够尽早的掌握多声部合作技能。本文主要是对小学低段多声部器乐的教学方式进行探究，笔者认为渐进式教学是现阶段最科学、有效的教学方式，并提出几点具有实践意义的策略，以期起到抛砖引玉的作用。

简介：摘要目的探讨癌相关成纤维细胞(CAFs)来源外泌体微小RNA(miR)-520e对前列腺癌细胞多西他赛耐药性的影响及其机制。方法2019年5月至2019年12月，从福建医科大学附属第一医院泌尿外科前列腺癌手术患者癌旁组织获取原代CAFs，提取并鉴定CAFs外泌体后，将其与PC-3细胞共培养，细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测其在高浓度(30 nmol/L)、低浓度(5 nmol/L)多西他赛条件下细胞增殖能力，计算细胞抑制率。构建高表达及低表达miR-520e的CAFs，提取外泌体后与PC-3细胞共培养，检测其对细胞增殖能力的影响，并计算细胞抑制率。进一步，通过蛋白质印迹法(Western blot)检测Hippo信号通路标志蛋白水平，验证此通路是否参与外泌体miR-520e调控PC-3细胞多西他赛耐药过程。使用方差分析和独立样本t检验比较组间差异。结果PC-3细胞抑制率与多西他赛浓度呈正比(Pearson r＝0.826，P<0.05)；加入CAFs来源外泌体后，高、低浓度多西他赛组细胞抑制率分别为(50.510±2.389)%和(28.233±5.441)%，均低于对照组(t＝12.010，P<0.05和t＝5.614，P<0.05)。高、低表达miR-520e外泌体处理组中，PC-3细胞抑制率分别为(26.355±1.539)%和(72.965±1.777)%，与对照组[(59.856±2.570)%]比较，差异均有统计学意义(t＝19.370，P<0.05与t＝7.270，P<0.05)。此外，高表达miR-520e外泌体处理组LATS1表达水平低于对照组(0.481±0.005比1.765±0.015，t＝139.200，P<0.05)，YAP表达高于对照组(0.932±0.001比0.688±0.005，t＝81.850，P<0.05)；而低表达miR-520e外泌体处理组则相反，LATS1表达高于对照组(2.370±0.050比1.765±0.015，t＝16.770，P<0.05)，YAP表达则低于对照组(0.371±0.002比0.688±0.005，t＝97.190，P<0.05)。结论CAFs来源外泌体miR-520e通过调控Hippo通路增强前列腺癌PC-3细胞对多西他赛的耐药。

简介：摘要目的观察聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）高表达对糖基化终末产物（AGEs）诱导下RPE细胞损伤的保护作用。方法将体外培养的人RPE细胞分为正常对照组（N组）、空白对照组（N+ AGAGEs组）、空载体对照组（Vec+AGEs组）、PSF高表达组（PSF+AGEs组）。N组RPE细胞常规培养；N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导；Vec+AGEs组、PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将pcDNA空载体或pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外，其余3组细胞进行相应的转染处理，24 h后应用150 μg/ml的AGEs刺激72 h。采用HE染色和Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡相关形态改变的影响；通过ROS水平检测分析PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响；采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响；采用Western blot检测PSF不同作用时间及不同剂量对血红素氧合酶1(HO-1）表达的影响。结果HE染色和Hoechst 33258染色观察发现，N组细胞形态饱满，细胞核呈圆形，细胞质丰富，染色均一；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小，嗜酸性染色增强，细胞核致密浓染、固缩甚至碎裂；PSF+AGEs组细胞形态尚饱满，细胞浆染色较均匀，细胞核染色均一。MTT比色法检测结果显示，PSF高表达可有效提高RPE细胞生存力，但该作用可被ZnPP有效拮抗，且差异有统计学意义（F=33.26，P<0.05）。DCFH-DA法检测结果显示，与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较，PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降，差异有统计学意义（F=11.94，P<0.05）。Western blot检测结果显示，PSF蛋白以时间、剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高，差异有统计学意义（F=164.91，P<0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 μg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0 μg明显升高，差异有统计学意义（F=104.82，P<0.05 ）。结论PSF可能通过上调HO-1的表达而抑制ROS产生，从而对AGEs诱导下的RPE细胞损伤发挥保护作用。

简介：摘要目的观察慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）对氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠视网膜新生血管的抑制作用。方法5日龄C57BL/6J小鼠112只随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型＋慢病毒空载体处理组（以下简称Vec组）及OIR模型+ PSF慢病毒处理组（以下简称PSF组），分别为16、32、32、32只。小鼠7日龄时，正常对照组小鼠常规环境饲养；单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠建立OIR模型。小鼠12日龄时，Vec组、PSF组小鼠玻璃体腔分别注射滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1 μl。正常对照组和单纯OIR模型组小鼠不再做任何处理。小鼠17日龄时，采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核；作视网膜铺片，测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积；采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中NF-E2相关因子2 （Nrf2）和血红素氧合酶1(HO-1）的mRNA相对表达量；采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1及PSF的蛋白相对表达量。组间比较采用单因素方差分析。结果正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个；视网膜无灌注区面积分别为0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数及视网膜无灌注区面积比较，差异均有统计学意义（F=24.87、165.70，P<0.05 ）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组较正常对照组突破内界膜的血管内皮细胞核数增多，视网膜无灌注区面积增大；PSF组较单纯OIR模型组、Vec组突破内界膜的血管内皮细胞核数减少，视网膜无灌注区面积减小，差异均有统计学意义（P<0.05 ）。实时定量PCR及Western blot检测结果显示，4组间小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量（F=53.66、83.54）以及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量（F=58.38、52.69、24.79）比较，差异均有统计学意义（P<0.05 ）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低，PSF组小鼠视网膜Nrf2、PSF mRNA相对表达量及Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加，差异均有统计学意义（P<0.05 ）。结论慢病毒介导的PSF可通过上调Nrf2及HO-1的表达抑制OIR小鼠视网膜新生血管形成。

简介：摘要目的观察探讨聚嘧啶束结合蛋白相关剪接子（PSF）高表达对糖基化终末产物（AGEs）诱导下人视网微血管内皮细胞（hRMECs）氧化损伤的保护作用及相应分子机制。方法将hRMECs分为正常组、空载组、PSF组、锌原卟啉（ZnPP）组及PSF+ ZnPP组进行实验。正常组细胞使用含有10％胎牛血清、青霉素/链霉素的DMEM培养基，置于37 °C、95％空气、5% CO2的密闭恒温培养箱中培养。空载组细胞采用空载慢病毒感染。PSF组细胞采用过表达PSF慢病毒感染。ZnPP组细胞采用ZnPP （10 mol/L）处理2 h。PSF+ZnPP组细胞采用过表达PSF慢病毒感染后，再用ZnPP （10 mol/L）预处理2 h。后四组细胞辅以AGEs刺激，HE、Hoechst33258染色法和流式细胞法观察PSF高表达对细胞损伤的保护作用以及ZnPP对PSF的拮抗作用。采用Western blot检测细胞中血红素氧合酶-1 (HO-1)、磷酸化（p）细胞外调节蛋白激酶（ERK）、核因子2相关因子2 （Nrf2）的蛋白表达。引入ERK通路的特异性拮抗剂U0126，Western blot验证U0126对PSF蛋白所诱导的HO-1表达的逆转作用。结果HE染色和Hoechst33258染色结果显示，PSF组受损细胞核数较正常组明显增加，较PSF+ZnPP组明显减少，差异均有统计学意义（F=27.5、38.7，P<0.05）。流式细胞法结果显示，PSF组细胞产生的ROS较正常组明显增加，较PSF+ZnPP组明显减少，差异有统计学意义（F=126.4，P<0.05）。Western blot检测结果显示，PSF组HO-1蛋白表达量较正常组、空载组明显增加，差异均有统计学意义（F=70.1，P<0.05）；AGEs处理30、60、120、240 min时pERK的蛋白表达量与15 min时比较，差异均有统计学意义（F=474.0，P<0.05）；PSF+/U0126-组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF-/U0126-组明显增加，PSF+/U0126＋组HO-1、Nrf2蛋白表达量较PSF+/U0126-组明显降低，差异有统计学意义（F=30.2、489.4，P<0.05 ）。结论PSF高表达可以通过活化ERK通路，促进Nrf2转位入核进而诱导HO-1表达，从而保护hRMECs免受AGEs诱导的氧化损伤。