简介:摘要目的探讨砷及其主要代谢产物对人肺腺癌细胞系A549细胞凋亡及促凋亡基因Bad和Bik表达的影响。方法于2020年10月,复苏培养A549细胞,利用细胞计数试剂CCK-8检测细胞活力,确定亚砷酸钠(NaAsO2)染毒A549细胞的浓度和时间。研究分为NaAsO2染毒组和代谢产物染毒组:NaAsO2染毒组染毒剂量为0(对照组)、20、40、60 μmol/L;代谢产物染毒组包括60 μmol/L一甲基胂酸(MMA)染毒组、60 μmol/L二甲基胂酸(DMA)染毒组。采用Hoechst33342/碘化丙啶双染法(Ho/PI)观察细胞凋亡情况,采用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qRT-PCR)检测染毒后细胞Bad和Bik mRNA表达水平,采用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测Bad蛋白、磷酸化Bad(P-Bad-S112)蛋白、Bik蛋白、裂解Bik蛋白及下游蛋白多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP1)和细胞色素C(Cyt-C)的相对表达情况,采用分光光度法检测半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)3、6、8、9的活性变化。结果与对照组比较,20、40、60 μmol/L NaAsO2染毒组凋亡细胞占比明显增加,差异均有统计学意义(P<0.01)。与对照组比较,2.0、4.0、6.0 μmol/LNaASO2染毒组Bad mRNA表达水平、Bik mRNA表达水平升高,Bad蛋白、磷酸化Bad蛋白、Bik蛋白、裂解Bik蛋白、PARP1蛋白、Cyt-C蛋白相对表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05),Caspase 3、6、8、9活性明显上调,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较,DMA染毒组Bad mRNA表达水平为1.439±0.173,差异有统计学意义(P=0.024),Bik mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.788);MMA染毒组Bad和Bik mRNA表达水平差异无统计学意义(P=0.085、0.063)。与对照组比较,MMA染毒组Bad、Bik、PARP1、Cyt-C蛋白相对表达量(0.696±0.023、0.707±0.014、0.907±0.031、1.032±0.016)差异无统计学意义(P=0.469、0.669、0.859、0.771);DMA染毒组Bad、Bik、PARP1、Cyt-C蛋白相对表达量(0.698±0.030、0.705±0.022、0.908±0.015、1.029±0.010)差异均无统计学意义(P=0.479、0.636、0.803、0.984)。结论NaAsO2可通过引起Bad和Bik蛋白过表达,启动磷酸化Bad的负反馈调节以及Bik的降解,激活下游蛋白PARP1、Cyt-C和Caspase途径,介导A549细胞凋亡。
简介:摘要目的探讨长期高脂饮食引起的胰岛素抵抗对pR5株系MAPT Tau转基因小鼠的认知功能和大脑Tau蛋白磷酸化的影响。方法8周龄雌性pR5 MAPT转基因小鼠分为标准饮食(standard diet,STD)组(pR5 STD,n=8)和高脂饮食(high-fat diet,HFD)组(pR5 HFD,n=8),以STD喂养的雌性野生型(wild type,WT)C57BL/6小鼠为对照组(WT STD,n=8),连续干预30周,直到小鼠老龄。实验期间小鼠每周测量1次体质量,每2周测量1次空腹血糖。30周后进行葡萄糖耐量实验、胰岛素耐量实验;采用强迫游泳实验和悬尾实验评估小鼠抑郁样行为,高架十字迷宫实验评估焦虑样行为,Morris水迷宫空间探索实验评估记忆行为;Western blot检测大脑组织总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白H7-tau、p-tau-Ser396和p-tau-Thr231表达水平。采用SPSS 17.0进行统计分析,葡萄糖耐量数据和胰岛素耐量数据采用重复测量方差分析,其他数据多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD检验。结果高脂饮食30周时,三组小鼠的体质量和空腹血糖均差异有统计学意义(F=808.31,1 117.18,均P<0.01)。pR5 HFD组小鼠的体质量[(54.35±2.52)g]高于pR5 STD组[(24.95±1.15)g]和WT STD组[(23.86±1.10)g](均P<0.01),pR5 HFD组小鼠空腹血糖[(8.12±0.24)mmol/L]高于pR5 STD组[(4.64±0.13)mmol/L]和WT STD组[(4.45±0.22)mmol/L] (均P<0.01)。葡萄糖耐量实验显示,三组小鼠注射葡萄糖后的120 min内,血糖值存在显著时间和组别交互作用(F=113.30,P<0.01),pR5 HFD组小鼠注射葡萄糖后血糖升高的峰值延迟,提示pR5 HFD组小鼠葡萄糖耐量受损。胰岛素耐量实验显示,三组小鼠的胰岛素耐量存在显著的时间和组别的交互作用(F=209.92,P<0.01)。pR5 HFD组小鼠注射胰岛素后,血糖下降较慢,在60 min时即达谷值,之后血糖显著回升,提示pR5 HFD组小鼠对胰岛素的敏感性显著降低。三组小鼠强迫游泳不动时间百分比和悬尾不动时间百分比均差异有统计学意义(F=37.05,59.29,均P<0.01),pR5 STD组和pR5 HFD组的这两个指标均高于WT STD组(均P<0.01),且pR5 HFD组高于pR5 STD组(P<0.01)。高架十字迷宫结果显示,三组小鼠在开放臂中的活动距离和活动时间均差异有统计学意义(F=7.82,10.37,均P<0.05)。pR5 HFD组小鼠的活动距离[(0.40±0.21)m]和活动时间[(27.38±8.80)s]均低于pR5 STD组[(2.31±1.74)m,(63.56±27.52)s](均P<0.05)。空间探索实验显示,pR5 HFD组小鼠目标象限停留时间[(15.56±1.16)s]少于pR5 STD组[(19.18±0.64)s](P<0.01),pR5 HFD组小鼠进入平台区域时间[(1.43±0.06)s]少于pR5 STD组[(1.66±0.12)s](P<0.01)。Western blot结果显示,三组小鼠总Tau蛋白、H7-tau、p-tau-Ser396和p-tau-Thr231蛋白表达水平均差异有统计学意义(F=101.50,80.60,55.47,30.89,均P<0.05)。两两比较显示,pR5 STD组、pR5 HFD组四种Tau蛋白表达均高于WT STD组(均P<0.01),pR5 HFD组均高于pR5 STD组(均P<0.05)。结论长期高脂饮食引起肥胖、高血糖和外周胰岛素抵抗,促进了MAPT小鼠的认知损害,与MAPT小鼠大脑中Tau蛋白磷酸化增加有关。