肉胨中脂含量对虫草生长的影响

肉胨中脂含量对虫草生长的影响

郭新炯

杭州中美华东制药江东有限公司

摘要目的：以摇瓶生长状态为指标，通过对肉胨脂含量种类及浓度进行检测分析，找出影响种子生长的主要物质及控制上限。方法：对数批试验罐生长不佳的培养基原料进行分析，确定影响生长的主要原料。对该原料进行理化指标分析，找出该原料中影响发酵的主要组分，通过单因素实验分别开展了培养基配比、原料搭配对组分敏感度的摇瓶实验，在此基础上进行不同浓度的返加实验，确定抑制因子的控制指标。结果：通过小试确定肉胨是影响生长的主要物质，该肉胨物理指标及营养组分与对照组一致，但脂质含量明显偏高，进一步对肉胨的理化指标进行分析，使用LS鱼胨和AQ肉胨的组合对脂质敏感性最高。在此基础上对肉胨的脂质进行不同浓度的返加实验，最终确定把肉胨脂质的上限确定为0.2%水平。

关键字：发酵虫草  氮源脂质

1. 引言

氮源是天然培养基和半合成培养基的主要组成部分，是影响虫草产量和质量的主要因素之一。也是发酵行业降低成本，提高设备利用率的关键环节。由于氮源的成分复杂，代谢途径难以把握，为适应不同类别的菌种发酵，目前较大的氮源厂商均开发特定型号的氮源产品，但价格大都居高不下，难以适用大规模生产。虫草发酵过程中，氮源的比例占培养基组分的1/3左右，以小试数据看，发酵异常批多数与氮源的变化有所关联。找出氮源中影响生产菌种生长的关键因子并优化控制，在提升产品质量的前提下节约原料成本是目前虫草生产中需要解决的重要问题之一。

2. 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌种

实验所用菌种均为试验罐9、10天移种种子。

2.1.2 培养基及溶液

略。

2.2 检测方法

2.2.1 干重

量取发酵液1000ml，通过150目滤布抽滤至基本无水滴下，105℃烘干至恒重。

2.2.2 脂质

称取样品5g，滤纸包裹放入提取装置中，加入100ml石油醚，70℃水浴加热3.5h后水浴挥干，105℃恒重3h称重M。脂含量=M/5*100%。

2.2.3 游离氨基酸

称取样品60mg（肉胨120mg），加10mL纯化水溶解，测定体积；加入等体积的5%磺基水杨酸，混匀过膜；将溶液pH调至2.2，测定体积；过膜至进样瓶，放入氨基酸分析仪进行分析。

2.3 试验方法

2.3.1 试验肉胨对发酵的影响验证

1、试验肉胨的发酵情况

取对照、试验肉胨配制补料培养基正常灭菌。

接种2级、3级种子，120rpm、15±2℃培养7天放瓶检测干重。

2、试验批肉胨梯度实验

同上组。

2.3.2 试验原料理化指标分析

1、内控数据分析

对试验批次、正常批次肉胨的外观性状、水分、氨基氮、pH等数据进行对比分析。

2、主要游离氨基酸对比

参照游离氨基酸检测方法，对正常肉胨、试验肉胨主要类别游离氨基酸进行对比分析。

3、脂含量对比分析

依照脂含量检测标准，对发酵正常肉胨、试验肉胨脂含量进行分析。

使用上述肉胨分别配制3级培养基，接种2级种子发酵7天放瓶检测干重生长情况。

4、脂肪酸浓度检测

根据GB 5009.168-2016《食品中脂肪酸的测定》，检测肉胨中常见脂肪酸种类及浓度。

2.3.3 脂含量指标的确认

1、空白组对肉胨脂质抑制的影响

分别选择不同来源的鱼胨、肉胨配制3级空白组培养基，装液量1000ml/5000ml，其余碳氮源均保持一致。

对照组不添加脂质，其余组别分别加入0.06g/L肉胨提取脂质，灭菌后震荡均匀使脂质溶解完全。

接种2级种子，培养7天放瓶，考察加脂组别相比对照组的干重降低程度。

2、肉胨脂质添加量实验

在上组配方基础上梯度添加试验肉胨提取的脂质，考察各组干重状态。

3、结果与分析

3.1 试验批原料的验证

3.1.1 试验批次肉胨的发酵情况

2个批次实验肉胨在补料培养基下生长异常，结球明显，对照组生长正常。

3.1.2 试验批肉胨梯度实验

图1.实验批次肉胨梯度实验

从图1看，实验肉胨不添加组别生长正常，0.25%组别干重最高，浓度增加至0.5%后结球严重，说明肉胨中存在抑制生长因素，该因素在实验肉胨浓度高于0.25%以上时导致菌丝结球严重，影响菌丝的生长。

3.2 试验原料理化指标分析

3.2.1 内控数据分析

实验肉胨发酵试验批次与正常批的物理状态、质量指标均符合内控要求，两组肉胨在甘氨酸含量、溶氨两项指标差异比较大。通过前期的甘氨酸添加实验及氨添加实验情况看，甘氨酸及溶氨在该水平差异上不会导致干重的巨大变化，在现有上述指标外还存在对发酵产生巨大影响的因素需要确认和控制。

3.2.2 主要游离氨基酸对比

主要游离氨基酸中（≥0.5）中，除甘氨酸外，实验原料与正常原料在丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸等主要氨基酸没有明显差别。

3.2.3 脂含量对比分析

从脂质对比实验数据看，发酵表现异常的肉胨所含脂质均高于0.8%以上，发酵正常的肉胨脂含量均低于0.1%。

图4.肉胨脂质与发酵干重的关联

从图2数据看，肉胨的含脂量与发酵干重呈明显的负相关性，含脂量较高的组别对干重的抑制作用很强，摇瓶培养3天左右开始出现结球且持续至放瓶无改善，含脂量较低组别的肉胨发酵正常。

3.2.4 脂肪酸浓度检测

肉胨提取的脂质颜色较深，有腐败气味，较易溶于液化料中。送检肉胨进行脂肪酸检测，含量最高的分别是软脂酸、硬脂酸、油酸和亚油酸，不饱和脂肪酸。脱脂后原料中脂肪酸盐浓度均有所下降，不饱和脂肪酸下降幅度更大。

3.3 脂含量指标的确认

3.3.1 空白组对肉胨脂质抑制的影响

同样使用3级配方，加入等量脂质（第一组脂质为0.075g/L），当原料搭配不同时干重差别很大。为了保证试验中所有原料的安全性，后期选择对脂质最敏感的组别（LS鱼胨+AQ肉胨）做肉胨脂质添加实验。

3.3.2 肉胨脂质添加量实验

图3.肉胨脂质返加实验

从图3看，在选定的脂质添加水平上，0.02g/L（换算为肉胨脂质为0.26%）即对干重产生明显的影响（降低10%以上）。为保证原料实验的准确性，后期实验开展前，需将肉胨脂质控制在0.2%以下。

4.结论与讨论

经摇瓶验证，肉胨是引起小试生长异常的主要原因。进一步对试验原料的浓度、培养条件进行考察发现，该原料引起生长前期结球的原因不是培养条件的差异，而是存在某种抑制成分。肉胨脂含量高于0.6%均不生长，说明原料脂质是导致试验和实验试验的主要原因。

通过单因素实验分别开展了培养基配比、原料搭配对脂质敏感度的摇瓶实验，确认使用3级培养基做空白组、使用LS鱼胨和AQ肉胨的组合对脂质敏感性最高。在此基础上对肉胨、的脂质进行不同浓度的返加实验，确定脂质最佳控制浓度0.2%左右。