摘要
摘要目的探讨白细胞介素17(IL－17)修饰的小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)对异体小鼠皮肤移植的影响及机制。方法(1)取5只BALB/c小鼠(均为雌性，4～8周龄，性别、鼠龄下同)，处死后取股骨、胫骨和肱骨，采用全骨髓密度梯度离心联合贴壁分离法分离纯化培养BMSC，取第3代细胞行形态学观察，该代细胞经成骨、成脂诱导分化鉴定。第4代细胞经干细胞表面标志物鉴定。取第3～6代BMSC，经终质量浓度50 ng/mL小鼠重组IL－17预处理5 d后，行形态学观察。取IL－17预处理的BMSC和未经IL－17预处理BMSC标记碳花青荧光染料(CM－Dil)，行形态学观察并计算标记率。(2)取45只C57BL/6J小鼠，按随机数字表法分为磷酸盐缓冲液(PBS)对照组13只、单纯BMSC组16只、BMSC＋IL－17组16只。在小鼠皮肤移植术前1 d，单纯BMSC组13只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL未经CM－Dil标记的BMSC 0.1 mL，另3只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL CM－Dil标记的BMSC 0.1 mL；BMSC＋IL－17组13只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL未经CM－Dil标记的IL－17预处理的BMSC 0.1 mL，另3只小鼠经尾静脉注射5×106个/mL CM－Dil标记的IL－17预处理的BMSC 0.1 mL；PBS对照组13只小鼠经尾静脉注射0.1 mL PBS。取45只BALB/c小鼠作供体，将前述3组处理后的45只C57BL/6J小鼠作为受体，建立背－背全厚皮移植模型。于移植术后第2天，再次对3组小鼠注射与移植术前1 d一样的等量相应细胞或PBS。于移植术后第7天，分别取单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组中注射CM－Dil标记的BMSC和CM－Dil标记的IL－17预处理BMSC的3只小鼠，脱颈处死后采用荧光显微镜观察BMSC的CM－Dil示踪并计数。于移植术后第6天拆除敷料后，从单纯BMSC组注射未经CM－Dil标记的BMSC的13只小鼠和BMSC＋IL－17组注射未经CM－Dil标记的IL－17预处理BMSC的13只小鼠及PBS对照组13只小鼠中选取7只小鼠，记录移植皮片的存活时间。于移植术后第8天，从3组剩余的6只小鼠中分别取3只小鼠进行移植皮片的大体观察，酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中γ干扰素、IL－10、转化生长因子β(TGF－β)的水平，流式细胞仪检测脾脏CD4＋CD25＋叉头翼状螺旋转录因子p3(Foxp3)＋调节性T细胞(Treg)比例，行苏木精－伊红染色观察移植皮片的组织形态。于移植术后第14天，取3组剩余3只小鼠同前行组织形态观察。对数据行独立样本t检验、单因素方差分析、LSD检验。结果(1)培养5 d，经IL－17预处理的BMSC与未处理的BMSC形态和大小并无明显差别。(2)CM－Dil标记后，经IL－17预处理的BMSC与未处理的BMSC生长状态均较良好，标记率几乎可达100%。(3)移植术后第7天，单纯BMSC组小鼠皮片及邻近皮下组织CM－Dil标记阳性的BMSC数量为每100倍视野下(6.2±2.6)个，明显少于BMSC＋IL－17组CM－Dil标记阳性的IL－17预处理BMSC的每100倍视野下(15.0±5.3)个(t＝－2.962，P<0.05)。(4)单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片的存活时间分别为(13.3±1.2)、(17.0±1.5)d，明显长于PBS对照组的(8.7±0.8)d(P<0.01)，而BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片的存活时间明显长于单纯BMSC组(P<0.01)。(5)移植术后第8天，PBS对照组小鼠移植皮片大部分发黑变硬且结痂坏死，单纯BMSC组小鼠移植皮片大部分存活良好，BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片均存活良好。(6)移植术后第8天，与PBS对照组相比，单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组小鼠的血清中IL－10和TGF－β含量明显升高(P<0.01)，γ干扰素含量明显降低(P<0.01)；与单纯BMSC组相比，BMSC＋IL－17组小鼠的血清中IL－10和TGF－β含量明显升高(P<0.01)，γ干扰素含量明显降低(P<0.01)。(7)移植术后第8天，单纯BMSC组和BMSC＋IL－17组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg比例明显高于PBS对照组(P<0.01)，BMSC＋IL－17组小鼠脾脏CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg比例明显高于单纯BMSC组(P<0.01)。(8)移植术后第8天，PBS对照组小鼠移植皮片可见大量炎性细胞浸润，表皮、真皮坏死；单纯BMSC组小鼠移植皮片可见局灶性的炎性细胞浸润，仅有轻微的表皮变性；BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片皮肤附属器存活完好，同时有血管形成。移植术后第14天，单纯BMSC组小鼠移植皮片可见广泛的炎性细胞浸润，并有较重的表皮变性和局灶性坏死；BMSC＋IL－17组小鼠移植皮片可见局灶性的炎性细胞浸润和轻微表皮变性；PBS对照组小鼠移植皮片已完全坏死。结论IL－17可通过提高小鼠BMSC诱导免疫耐受的能力和增强BMSC的归巢能力，最终起到减轻异体皮片移植后免疫排斥反应，延长小鼠移植皮片存活时间的作用。
出版日期
2020年08月10日（中国期刊网平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）
